樊雨梅，帖 航，解 曉，史傳超，周廣運，蘇 寧,*，廖 峰,*

（1.國家膠類中藥工程技術研究中心，山東 東阿 252201；2.東阿阿膠股份有限公司，山東 東阿 252201；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

目前，驢乳以其營養(yǎng)價值和潛在的健康效益逐漸引起人們的關注。與其他原料乳相比，驢乳最重要的特征是其化學成分與母乳類似[1]。因此，在牛乳蛋白過敏的情況下，與其他反芻動物乳相比，驢乳是良好的嬰兒營養(yǎng)替代品[1]。此外，驢乳的生理保健和疾病預防也引發(fā)了醫(yī)學界的關注，流行病學和機制研究已初步證明了驢乳具有一定的減輕氧化應激、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、改善免疫功能等作用[2-6]。

國內(nèi)外研究主要集中在探究驢乳的組成、物化和營養(yǎng)性質(zhì)以及功效，其中2011年在分子水平研究驢乳蛋白質(zhì)組成取得了重要的進展[7]。此后，關于驢乳蛋白質(zhì)組學的報道大量增加。研究表明，不同品種、同一品種中的個體動物之間的乳蛋白質(zhì)含量和相對蛋白質(zhì)組成不同[8-9]。雖然，目前關于驢乳的研究較多，但是德州驢作為我國主要品種之一，蛋白質(zhì)組成的研究較少。因此，本實驗以德州驢乳粉為研究對象，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、二維電泳、圓二色譜和基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of fight-mass spectrometry，MALDITOF/TOF-MS）等技術手段揭示德州驢乳粉蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結構和組成，以期為德州驢乳的深層次開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍干驢乳粉 東阿阿膠股份有限公司。

乙腈、甲醇、甲酸（均為質(zhì)譜純） 百靈威科技有限公司；牛血清白蛋白、尿素、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、CHAPS 北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Tris-base 美國阿拉丁公司；苯甲基磺酰氟 上海碧云天生物技術有限公司；Bio-Lyte 3-10 buffer、Ready Strip IPG Strips、Modified Trypsin（Sequencing Grade，Promega）SDS-PAGE Marker、毛細管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis，CGE）Marker美國Bio-Rad公司；HiLoad 16/60 Superdex 200 pg制備級分子篩分離柱 美國通用電氣公司。

1.2 儀器與設備

Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MALDI-TOF/TOFMS、Multiskan GO多功能酶標儀 美國Thermo公司；Mini Protean 3 Cell SDS-PAGE儀、Protean IEF cell雙向凝膠電泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE）儀美國Bio-Rad公司；P/ACETM MDQ CGE儀 美國貝克曼庫爾特有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國通用電氣公司；MOS 450圓二色譜儀 法國Bio Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)特性的測定

1.3.1.1 BCA法測定蛋白質(zhì)含量

按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的方法檢測驢乳粉的蛋白質(zhì)含量。

1.3.1.2 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量范圍

根據(jù)劉曉等[10]的方法稍作修改。10%驢乳粉溶液稀釋10 倍后，加入等量含DTT的2×Loading Buffer緩沖液，充分混勻，沸水浴5 min。濃縮膠5%，分離膠12%。上樣量10 μL，將凝膠掃描電子圖譜保存，電泳所用的Marker分子質(zhì)量范圍為10～250 kDa。

1.3.1.3 CGE分析蛋白質(zhì)相對豐度

參考文獻[11]的方法，略有改動。毛細管規(guī)格為內(nèi)徑100 μm，總長31 cm，有效長度20 cm，柱體溫度40 ℃，電動進樣，進樣電壓-10 kV，進樣時間1 s，分離電壓-12.4 kV，紫外檢測波長280 nm，樣品貯存溫度30 ℃。

1.3.1.4 2-DE分析蛋白質(zhì)等電點范圍

根據(jù)陳靜廷等[12]的方法，稍作修改。200 μL 10%驢乳粉溶液與800 μL的水化液混勻。取200 μL加載到電泳池，等電聚焦程序見表1。

表1 7 cm膠條的等電聚焦程序Table 1 IEF program for 7 cm latex

等電聚焦后立即進行膠條平衡。平衡分兩步，每次15 min，分別使用5 mL含1% DTT平衡液和5 mL含2.5%碘乙酰胺平衡液。將平衡好的膠條置于12%聚丙烯酰胺凝膠上，并用1%的瓊脂糖固定膠條，進行第二向電泳。凝膠用考馬斯亮藍染色后，以脫色液脫去背景顏色，使用凝膠成像設備掃描成電子圖片保存。

1.3.2 蛋白質(zhì)二級結構的表征

1.3.2.1 蛋白質(zhì)的分離純化

酪蛋白的純化：稱取一定量的驢乳粉，加入2.5 倍質(zhì)量的50～55 ℃水充分溶解乳粉，將配制好的醋酸-醋酸鈉溶液緩慢加入驢乳溶液中，直至淡黃色塊狀膠體完全沉淀為止。在加入緩沖液過程中，使用pH計控制緩沖液的pH值范圍在4.6～4.8之間。3 000 r/min離心15 min，上清液為乳清蛋白粗品，沉淀為粗品酪蛋白。將粗品酪蛋白用無水乙醇沉淀3 次，每次洗滌后3 000 r/min離心15 min，最終得到白色潔凈的酪蛋白，將酪蛋白移至表面皿中進行減壓真空干燥。

乳清蛋白純化：乳粉乳清蛋白質(zhì)粗品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。利用分子篩純化驢乳粉乳清蛋白。具體條件如下：層析柱條件：HiLoad 16/60 Superdex 200 pg制備級分子篩純化層析柱，內(nèi)徑16 mm，柱床高度600 mm，柱床體積120 mL，分離范圍10～600 kDa；AKTA純化系統(tǒng)運行參數(shù)：流速恒定2 mL/min，室溫環(huán)境純化（20～25 ℃），最大壓力0.3 MPa，緩沖體系pH 8.0（含100 mmol/L氯化鈉的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液），上樣量3 mL，檢測器包含紫外檢測器（280、254、215 nm）、pH檢測器、電導率檢測器和溫度檢測器。

1.3.2.2 圓二色譜法檢測蛋白質(zhì)二級結構

參考文獻[13]的方法，略有改動。0.5 mg/mL左右的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜處理后進行遠紫外圓二色譜掃描，超純水作為空白。測定條件：0.1 cm石英比色杯，溫度25 ℃，光徑0.1 cm，帶寬1 nm，掃描范圍250～190 nm，掃描速率0.5 nm/s，用平均殘基摩爾橢圓率[θ]表示圓二色譜光譜數(shù)據(jù)，單位為（deg·cm2）/dmol，通過在線引擎采用SELCON3程序估算蛋白質(zhì)的二級結構（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml），匹配方式為Closest matching solution with all proteins。

1.3.3 蛋白質(zhì)組成分析

驢奶粉經(jīng)SDS-PAGE分離后，將3 個明顯的蛋白區(qū)域分成3 份切開，轉移至EP管中。蛋白質(zhì)的脫色酶切方法參考文獻[14]。濃縮液與基質(zhì)混合后，采用MALDI-TOF/TOF-MS分析。利用Mascot軟件的SwissPort數(shù)據(jù)庫進行搜索。檢索分類（Taxonomy）為Equus caballus，Mascot檢索P值小于0.05和Mascot得分大于41 分的結果被認為鑒定成功。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以3 次重復實驗每次同時做平行實驗所得的數(shù)據(jù)為結果，用平均值表示。

2 結果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)

2.1.1 蛋白質(zhì)含量的分析

利用BCA法測定驢乳粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為16.10%，折合驢乳蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)約為1.61%，這與相關研究[15-16]結果一致。

2.1.2 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的分布

圖1 驢乳粉SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profile of donkey milk powder

如圖1所示，分子質(zhì)量主要分布在3 個區(qū)域，10～20 kDa小分子質(zhì)量的乳清蛋白區(qū)域，28～36 kDa的酪蛋白區(qū)域，53～78 kDa的大分子乳清蛋白區(qū)域。通過分子標記物條帶和相關報道[15,17-20]的驢乳蛋白質(zhì)遷移模式，識別出以下蛋白：乳鐵蛋白（分子質(zhì)量約為75 kDa）、血清白蛋白（分子質(zhì)量約為67 kDa）、免疫球蛋白（分子質(zhì)量約為60 kDa）、酪蛋白（分子質(zhì)量約為28～36 kDa）、β-乳球蛋白（分子質(zhì)量約為18 kDa）、溶菌酶（分子質(zhì)量約為15 kDa）、α-乳清蛋白（分子質(zhì)量約為14 kDa）。

2.1.3 蛋白質(zhì)豐度

圖2 驢乳粉GCE結果Fig. 2 GCE spectra of donkey milk powder

由圖2可以看出，驢乳粉蛋白質(zhì)主要集中在酪蛋白區(qū)域和小分子質(zhì)量乳清蛋白區(qū)域，且酪蛋白豐度低于小分子質(zhì)量乳清蛋白豐度，這與Salimei[17]、張巖春[21]、Malacarne[22]等的報道一致。人乳乳清蛋白約占總蛋白50%，而牛乳的乳清蛋白不足20%[23]，由此可見，與牛乳相比，驢乳更接近于人乳，更易被消化吸收。酪蛋白與乳清蛋白的比值是牛乳致敏能力的重要影響因素[24]，Cunsolo等[8]通過綜合分析驢乳的相關臨床研究發(fā)現(xiàn)，低酪蛋白與乳清蛋白比率是驢乳低致敏性的主要因素之一。

2.1.4 蛋白質(zhì)等電點

圖3 驢乳粉2-DE圖Fig. 3 2-DE profile of donkey milk powder

如圖3所示，水平方向為第一固相pH值梯度等電聚焦，垂直向為第二向垂直板SDS-PAGE。驢乳粉蛋白的等電點均勻分布在4.5～6.5之間，與人體pH值酸堿環(huán)境相近。驢乳蛋白質(zhì)條帶清晰單一，結構完整，與Vincenzetti等[25]的報道驢乳蛋白質(zhì)二維電泳結果一致。A區(qū)域分子質(zhì)量為28～36 kDa，pI在4.5～6之間；B區(qū)域分子質(zhì)量約為19 kDa，pI在5～5.5之間；C區(qū)域分子質(zhì)量為7～19 kDa，pI在5～6之間；D區(qū)域分子質(zhì)量約為19 kDa，pI在6.5左右。根據(jù)驢乳常見蛋白分子質(zhì)量的大小和pI可推斷[8,25]，A區(qū)域蛋白為酪蛋白，B區(qū)域蛋白為β-乳球蛋白，C區(qū)域蛋白為α-乳清蛋白。

2.2 蛋白質(zhì)結構的表征

2.2.1 蛋白質(zhì)的分離純化

圖4 驢乳粉分子篩純化洗脫圖Fig. 4 Molecular sieve gel chromatographic patterns of donkey milk powder

從圖4可以看出，組分1和組分2之間并無明顯280 nm吸收峰，且電泳圖譜中也并未發(fā)現(xiàn)明顯酪蛋白條帶，由此可見，經(jīng)第1步粗分離后，酪蛋白和乳清蛋白已基本分離。第2步經(jīng)分子篩純化，由圖4可以找到3 個典型性蛋白峰，非常明顯3 個典型性蛋白質(zhì)峰對應3 個不同分子質(zhì)量的區(qū)域的蛋白質(zhì)，分別為大分子質(zhì)量乳清蛋白和2 個不同分子質(zhì)量的小分子質(zhì)量乳清蛋白。由圖4可知，在驢乳粉純化蛋白質(zhì)峰前，有一個215 nm吸收峰，該處峰可能為糖類分子及其他大分子雜質(zhì)。經(jīng)凍干稱質(zhì)量計算驢乳粉蛋白質(zhì)綜合回收率在90%以上。

由圖5可以看出，經(jīng)等電點沉淀分離酪蛋白，再經(jīng)分子篩純化乳清蛋白，電泳條帶非常清晰，可得到較為單一的蛋白質(zhì)組分。由此可見醋酸-醋酸鈉等電點沉淀配合Superdex分子篩純化乳粉中的蛋白質(zhì)方法較為理想，為后期靶向研究蛋白功能，開發(fā)功能性蛋白分子提供理論依據(jù)。

2.2.2 蛋白質(zhì)二級結構分析

表2 各純化蛋白質(zhì)組分的二級結構分析Table 2 Secondary structures of purified protein components from donkey mild powder

如表2所示，驢乳粉中的酪蛋白二級結構主要以β-折疊、無規(guī)卷曲和β-轉角為主；大分子質(zhì)量乳清蛋白α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲比例較為均衡；小分子質(zhì)量乳清蛋白仍主要以β-折疊、無規(guī)卷曲和β-轉角為主。這與預期結果一致，Aspre等[26]報道驢乳主要富含脯氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。而脯氨酸具有環(huán)狀結構有利于β-轉角的形成，纈氨酸和異亮氨酸易形成β-折疊。劉微等[27]也報道人乳β-酪蛋白單體二級結構以β-折疊、無規(guī)卷曲和β-轉角為主，推測驢乳酪蛋白二級結構與母乳類似，可能是驢乳低致敏性的原因之一。

2.2.3 蛋白質(zhì)組成的分析

利用SDS-PAGE結合MALDI-TOF/TOF-MS的方法，共鑒定出386 種蛋白質(zhì)，顯著高于Cunsolo等[7]報道的106 種蛋白、古麗巴哈爾·卡吾力等[14]報道的283 種蛋白、張新浩等[28]報道的216 個乳清蛋白。鑒定出的386 種蛋白質(zhì)，其中有72 種蛋白為未命名蛋白，剩余314 種已命名蛋白。在314 種已命名蛋白質(zhì)中，101 種成分是常見的驢乳蛋白，包括87 種免疫λ輕鏈可變區(qū)片段，剩余的14 種蛋白主要是酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、溶菌酶、血清白蛋白，見表3。除常見驢乳蛋白外，有139 種（約占總識別蛋白的36.01%）蛋白首次在驢乳中鑒定出的蛋白，見表4。

根據(jù)驢乳蛋白2-DE圖譜，酪蛋白部分存在一些蛋白斑點，經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS鑒定后，發(fā)現(xiàn)驢乳蛋白存在3 種酪蛋白：一種是β-酪蛋白（27 kDa，pI 4.91）和2 種α-S2-酪蛋白（27.2 kDa，pI 4.72；25.4 kDa，pI 4.8）。α-S2-酪蛋白的異質(zhì)性主要取決于磷酸化程度和RNA錯誤剪接事件產(chǎn)生的內(nèi)部缺失異構體[8]。研究表明，分子質(zhì)量25.4 kDa的蛋白與α-S2-酪蛋白的區(qū)別在于Asn176～Gln180五肽的缺失[29]。驢乳α-乳清蛋白A和α-乳清蛋白B/C（14.2 kDa）的發(fā)現(xiàn)與Bertino等[30]報道一致，α-乳清蛋白（16.3 kDa），是乳清蛋白（Met 90）的氧化甲硫氨酸形式，這是由于體內(nèi)氧化應激導致的α-乳清蛋白同種型[31]。驢乳β-乳球蛋白存在2 種不同的形式，β-乳球蛋白I和β-乳球蛋白II（同分異構體II B、C、D）[25]，但是在本次鑒別中只發(fā)現(xiàn)了3 種同分異構體，可能與所使用的鑒別方法的低敏感性有關。在驢乳中，已鑒定出2 個溶菌酶的變體，分子質(zhì)量分別為14.6 kDa和16.8 kDa，分子質(zhì)量的差異主要與49、52、61位氨基酸殘基不同有關[32]。值得注意的是，此次鑒別出的驢乳血清白蛋白含有607個氨基酸，分子質(zhì)量為68.3～68.6 kDa，與Cunsolo等[8]報道的驢乳血清白蛋白含有583 個氨基酸，分子質(zhì)量為65.584 kDa略有不同，但是與鮮馬奶血清白蛋白含有的氨基酸及分子質(zhì)量（607 個氨基酸，68.3 kDa）一致[13]。

表4 驢乳粉首次鑒定蛋白組分分析Table 4 Analysis of donkey milk powder protein components first identified in this study

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

3 結 論

本實驗主要研究德州驢乳粉蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結構和組成。研究表明，驢乳粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為16.10%，等電點均勻分布在4.5～6.5之間，分子質(zhì)量主要集中在10～20 kDa小分子質(zhì)量的乳清蛋白區(qū)域、28～36 kDa的酪蛋白區(qū)域和53～78 kDa的大分子乳清蛋白區(qū)域。驢乳粉酪蛋白和小分子質(zhì)量乳清蛋白二級結構主要以β-折疊、無規(guī)卷曲和β-轉角為主，大分子質(zhì)量乳清蛋白二級結構較為均衡。通過與馬科蛋白圖庫進行對比，檢索出386 種可識別的蛋白，其中有139 種蛋白首次在驢乳中發(fā)現(xiàn)，為揭示驢乳的生理功效提供理論基礎。