趙璐藐,郜海燕,劉瑞玲,丁玉庭,韓延超,陳杭君,*
(1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310014;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021)
芋艿(Colocasia esculenta L. Schott)屬天南星科,是多年生單子葉草本植物,其肉質(zhì)球莖,富含淀粉,食用價(jià)值高,原產(chǎn)于中國(guó)、印度等熱帶沼澤地區(qū)[1-3]。浙江奉化是我國(guó)最早栽培芋艿的地區(qū)之一,奉化芋艿肉質(zhì)細(xì)膩,個(gè)大皮薄,品質(zhì)極佳,深受大眾喜愛(ài)[4-5]。但新鮮芋艿水分高,采后易發(fā)生腐爛褐變[6]而失去商品價(jià)值,其采后病害問(wèn)題已成為浙江芋艿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題。
近年來(lái),對(duì)芋艿的研究主要集中于田間病蟲害及采后褐變。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,芋艿田間病害主要有芋疫病、炭疽病等[7-8],均由真菌引起,病原真菌侵染是引起果蔬采后病腐的主要原因[9],而目前關(guān)于芋艿采后病害問(wèn)題鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,分離鑒定芋艿采后主要病原菌,并針對(duì)性采取有效措施對(duì)減少芋艿采后貯藏?fù)p失及延長(zhǎng)貯藏期具有重大意義。為了延長(zhǎng)芋艿的保鮮期,前人研究以低溫保鮮[10]為主,但低溫不能有效阻止病原菌侵染,而植物提取物是存在于植物體內(nèi)通過(guò)化學(xué)或物理方法提取出的具有有效抑菌作用的物質(zhì)[11]。檜木醇是從扁柏樹中提取的一種單萜類天然化合物[12],具有抗菌、抗氧化以及抗腫瘤功效,是高安全性的植物提取成分[13-14]。有研究表明,檜木醇可控制桃子和茄子等采后病害[15],且能維持采后龍眼品質(zhì)[14],而其在芋艿采后病原菌控制方面還鮮見(jiàn)研究。
本研究采用傳統(tǒng)菌種分離法對(duì)浙江奉化芋艿采后常溫貯藏過(guò)程中的病原菌進(jìn)行分離純化,并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS序列分子學(xué)鑒定,旨在明確主要病原菌的種類;同時(shí)研究檜木醇溶液處理對(duì)芋艿采后主要病原菌的抑菌效果,以期為后續(xù)采取針對(duì)性的研發(fā)綠色防腐保鮮技術(shù)提供理論參考依據(jù)。
芋艿采自浙江寧波奉化芋艿基地,選擇大小均一、無(wú)明顯病蟲害的健康芋艿,于室溫下貯藏。貯藏期間,定期觀察發(fā)病情況并將其病原菌分離進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
檜木醇(純度>99%) 梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth,PDB) 上海盛思生物科技有限公司。
MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器 松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社;MJX-160B-Z霉菌培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超凈工作臺(tái) 江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司;H7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;UV9000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;axio-vert倒置熒光顯微鏡 卡爾·蔡司股份公司。
1.3.1 病原菌分離純化
參照文獻(xiàn)[16],將貯藏過(guò)程中自然發(fā)病的芋艿按不同病癥分組,采用常規(guī)組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化,反復(fù)純化出現(xiàn)單菌落后轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng),菌種編號(hào)并低溫保存,用于菌落形態(tài)觀察及鑒定。
1.3.2 病原菌致病性檢測(cè)
選用健康無(wú)傷的芋艿,采用針刺法將純化后的絲狀真菌塊回接至芋艿刺傷部分,以不接真菌塊為對(duì)照,于室溫貯藏,定期觀察芋艿發(fā)病癥狀,顯出病癥后再次對(duì)其進(jìn)行分離鑒定,觀察菌株是否與接種菌一致,以便判斷主要致病菌。每個(gè)病原菌處理3 個(gè)重復(fù)。
1.3.3 病原菌形態(tài)觀察
將保存的純病原菌活化,并接種于PDA培養(yǎng)基中,25 ℃恒溫箱培養(yǎng)至產(chǎn)孢,于熒光顯微鏡下觀察菌絲體及孢子形態(tài)并拍照。
1.3.4 病原菌rDNA-ITS序列與系統(tǒng)發(fā)育分析
采用CTAB法提取和純化基因組DNA[17]。利用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對(duì)病原菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物合成委托杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。擴(kuò)增程序:98 ℃預(yù)變性2 min,98 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,35 個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。
上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,切下目的片段進(jìn)行回收,由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),并利用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,尋找同源性較高的已知序列。利用Neighbor-Joining法[18]構(gòu)建菌株親緣關(guān)系較近的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)合菌株形態(tài),確定菌株種屬。
1.3.5 體外抑菌
將一定量已配制好的檜木醇溶液加入已滅菌的PDA培養(yǎng)基中,制成檜木醇質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L的平板。用無(wú)菌打孔器在病原菌平板上取直徑6 mm的菌塊,放入PDA平板中央,在25 ℃條件下培養(yǎng),定期觀察菌落,用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑并記錄,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次求平均值。
1.3.6 孢子萌發(fā)率測(cè)定
參考Li Jiangkuo[19]和周靈靈[20]等方法,稍作修改。在無(wú)菌條件下,將病原菌孢子懸浮液分別混合于不同質(zhì)量濃度檜木醇的葡萄糖溶液中,分別取不同質(zhì)量濃度的終液50 μL滴入雙凹載玻片,將載玻片放置在培養(yǎng)皿中(直徑200 mm),于25 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng),在第6、12、18小時(shí)于顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況,每處理鏡檢孢子數(shù)不少于100 個(gè),以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑一半計(jì)為孢子萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,孢子萌發(fā)率計(jì)算公式如下:
1.3.7 丙二醛濃度測(cè)定
病原菌細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度可用丙二醛(malondialdehyde,MDA)濃度作為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。參考Li Jiangkuo等[19]的方法,稍作修改。稱取2.5 g(濕質(zhì)量)的菌絲體加入含有合適濃度的檜木醇溶液的PDB液體培養(yǎng)基中,搖床(25 ℃,140 r/min)培養(yǎng)0、3、6、9、12、24 h后,分別取2 mL上清液采用硫代巴比妥酸法測(cè)定吸光度,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.3.8 透射電鏡觀察
菌絲固定采用戊二醛、鋨酸雙重固定法。稱1 g菌絲(濕質(zhì)量)浸泡于3%戊二醛室溫下固定過(guò)夜,用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗15 min后用1%的鋨酸固定2 h(4 ℃),再經(jīng)乙醇梯度脫水、包埋、聚合。聚合后進(jìn)行切片處理,超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后,于透射電鏡下觀察菌絲體并拍照。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel 2010軟件整理,采用SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05,差異顯著),圖片繪制采用Origin 2017以及Photoshop CS4。
2.1.1 病原菌分離純化及致病性檢測(cè)結(jié)果
根據(jù)科赫法則,從芋艿的自然發(fā)病部位分離出3 株真菌,編號(hào)為CE-1、CE-2、CE-3,回接致病(圖1d、h)和再分離純化后確定芋艿采后致病菌為CE-1和CE-2,此2 種菌株能不同程度地導(dǎo)致芋艿發(fā)病腐爛,初期均從采摘受損處發(fā)病。CE-1菌使芋艿表皮出現(xiàn)白色絨狀物病斑,而后長(zhǎng)出白色菌絲使其腐爛,CE-2菌使表皮出現(xiàn)褐變進(jìn)而軟化,直至長(zhǎng)出灰黑色疏松菌絲。
CE-1菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)5 d后菌落形態(tài)如圖1b所示,CE-1菌落圓形,菌絲為白色或淺灰色,形如羊絨,菌落背面略帶黃色。菌絲有隔,分生孢子兩端較尖,呈鐮刀型或紡錘形,孢體稍彎曲(圖1c)。CE-2菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)3 d后菌落形態(tài)如圖1f所示,CE-2菌落圓形,絨狀菌絲叢,初期白色,后期轉(zhuǎn)為炭黑色,且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)生少許菌核。菌絲有隔,分枝,分生孢子黑褐色,卵圓形,基部平截,端部鈍圓,壁厚(圖1g)。
圖1 芋艿貯藏期發(fā)病果實(shí)病害癥狀、分離菌株菌落形態(tài)特征及其回接癥狀Fig. 1 Symptoms of postharvest diseases on taro, and morphology and pathogenicity of pathogens
2.1.2 病原菌rDNA-ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析
以病原菌基因組DNA為模板,采用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,2 個(gè)病原菌菌株均獲得1 條500 bp左右的擴(kuò)增條帶。將其序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn),菌株CE-1與鐮刀菌屬序列相似度達(dá)99%以上,菌株CE-2與可可毛色二孢菌序列相似度達(dá)99%以上,可信度較高。選取同源性高低不同的菌株進(jìn)行多重序列比較和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建(圖2),結(jié)果表明:菌株CE-1與茄病鐮刀菌(Fusarium solani,登錄號(hào):KF938479.1)親緣關(guān)系較近,與禾谷鐮刀菌(F. graminearum,登錄號(hào):KT318586.1)及層生鐮刀菌(F. proliferatum,登錄號(hào):KU984710)等鐮刀菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。菌株CE-2與可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae,登錄號(hào):MH454030.1)聚為一類。因此,結(jié)合2 種病原菌的形態(tài)特征鑒定,rDNA-ITS序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,確定引起芋艿采后病害的主要病原菌為Fusarium sp.和L. theobromae。
圖2 基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on ITS sequences
2.2.1 檜木醇體外抑菌效果
2 種病原菌菌落生長(zhǎng)速度不同,CE-1長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿需5 d時(shí)間,而CE-2則在2 d長(zhǎng)滿。從圖3可以看出,檜木醇溶液對(duì)芋艿采后2 種病原菌均有一定的抑菌效果,且隨質(zhì)量濃度的升高抑制能力增強(qiáng),相對(duì)來(lái)說(shuō),檜木醇對(duì)CE-2的抑制能力要弱于CE-1。質(zhì)量濃度為10 mg/L的檜木醇溶液對(duì)CE-1菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑菌效果,在培養(yǎng)3 d后不同質(zhì)量濃度處理間菌絲生長(zhǎng)有顯著差異(P<0.05),且質(zhì)量濃度為50 mg/L的檜木醇溶液完全抑制了CE-1的生長(zhǎng)。對(duì)于CE-2,檜木醇質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)對(duì)菌絲生長(zhǎng)有明顯抑制作用,在培養(yǎng)2 d后不同質(zhì)量濃度處理間菌絲生長(zhǎng)有顯著差異(P<0.05),且質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)完全抑制CE-2的生長(zhǎng)。
圖3 檜木醇處理對(duì)CE-1和CE-2菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Inhibitory effects of hinokitiol at different concentrations against mycellial growth of the two pathogens
2.2.2 檜木醇對(duì)病原菌孢子萌發(fā)率的影響
圖4 檜木醇處理對(duì)CE-1病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果Fig. 4 Inhibitory effects of hinokitiol at different concentrations on spore germination of the pathogens
為研究檜木醇對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果,進(jìn)一步分析了檜木醇溶液對(duì)CE-1在培養(yǎng)第6、12、18小時(shí)的孢子萌發(fā)率。由圖4可以看出,隨著檜木醇質(zhì)量濃度的增加,CE-1孢子萌發(fā)率顯著降低(P<0.05),18 h對(duì)照組孢子萌發(fā)率達(dá)到91.33%,而40 mg/L和80 mg/L檜木醇處理組孢子萌發(fā)率僅分別為32%和9.67%,其中孢子萌發(fā)抑制率分別約為66%和90%。在進(jìn)行CE-2孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)時(shí),采用普通培養(yǎng)基培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)產(chǎn)孢子困難,這與Saha等[21]研究結(jié)果一致。進(jìn)一步采用燕麥培養(yǎng)基及連續(xù)光照等方法進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng),培養(yǎng)26 d后產(chǎn)孢量依然很少,不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),檜木醇能顯著抑制CE-1病原菌孢子的萌發(fā),也由此抑制其菌絲生長(zhǎng)。
2.2.3 檜木醇對(duì)菌絲膜脂過(guò)氧化的影響
MDA是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物,是衡量膜系統(tǒng)氧化損傷的重要指標(biāo)之一[22]。為能明顯看出抑菌效果,選取抑菌率為60%以上的檜木醇處理菌種,即以40 mg/L質(zhì)量濃度處理CE-1和80 mg/L質(zhì)量濃度處理CE-2。從圖5a可以看出,質(zhì)量濃度為40 mg/L檜木醇溶液處理CE-1,在處理6 h后MDA濃度開始超過(guò)對(duì)照組并始終保持上升,于第24小時(shí)達(dá)到最高水平。從圖5b可以看出,質(zhì)量濃度為80 mg/L檜木醇溶液處理CE-2,其MDA濃度始終高于對(duì)照組。由此可見(jiàn),檜木醇能夠誘導(dǎo)芋艿采后兩種病原菌菌絲膜脂質(zhì)過(guò)氧化,加劇膜的損傷,促進(jìn)MDA的大量積累。MDA可與真菌的蛋白質(zhì)及核酸發(fā)生相應(yīng)反應(yīng),從而改變其結(jié)構(gòu),破壞其生物學(xué)功能,致使真菌死亡。
圖5 檜木醇處理對(duì)2 種病原菌菌絲脂質(zhì)過(guò)氧化影響Fig. 5 Effects of hinokitiol on membrane lipid peroxidation of the two pathogens
2.2.4 檜木醇對(duì)菌絲體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響
由圖6可知,檜木醇處理對(duì)CE-1和CE-2的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有明顯破壞的影響,對(duì)照組的2 種菌菌絲體細(xì)胞壁層次清楚,有明確界限的質(zhì)膜,厚度均勻且細(xì)胞器完整未受損傷。而經(jīng)檜木醇處理后的CE-1細(xì)胞膜部分模糊,厚度不均勻,菌絲體內(nèi)部分細(xì)胞質(zhì)解體出現(xiàn)空腔(圖6A、B)。CE-2菌絲體膜有溶解跡象,且菌絲體內(nèi)細(xì)胞器液泡化(圖6C、D)。2 種病原菌細(xì)胞完整性均遭到破壞,表明檜木醇對(duì)鐮刀菌屬和可可毛色二孢菌菌絲體有一定的破壞作用,促使膜脂質(zhì)過(guò)氧化而造成膜損傷,改變膜通透性,從而達(dá)到抑菌效果。
圖6 檜木醇處理對(duì)2 種病原菌菌絲體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響Fig. 6 Transmission electron micrographs of the two pathogens treated and not treated with hinokitiol
本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定以及致病性檢測(cè)方法,初步確定引起芋艿采后腐爛變質(zhì)的主要病原菌為鐮刀菌屬(Fusarium sp.)和可可毛色二孢菌(L. theobromae)。此2 種菌均能對(duì)芋艿采后造成不同程度的病變,其中可可毛色二孢菌引起的芋艿果實(shí)采后病害為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。可可毛色二孢菌可引起龍眼焦腐病[23]、橡膠樹葉斑病[24]、桑樹根腐病[25]以及枇杷采后病害[26],具有一定的致病力。守川俊幸等[27]研究發(fā)現(xiàn)茄病鐮刀菌可引起低溫貯藏的富山縣芋頭發(fā)病,這與本研究分離出鐮刀菌屬菌株有相同之處??赡芨鞯貐^(qū)不同品種芋艿采后病害不盡相同,而是否均能致病且有無(wú)存在復(fù)合侵染還有待進(jìn)一步研究。
我國(guó)植物資源豐富,其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物有40多萬(wàn) 種,不同植物有不同的抑菌活性成分,其結(jié)構(gòu)類型涉及醇類、萜類、生物堿類、精油類等化合物均有抑菌、殺菌或抗菌的功效[28]。研究表明,芳樟醇和檸檬醛[29]、香茅醇[30]、肉桂精油[31]、黃帚橐吾[32]等植物提取物分別對(duì)柑橘褐色蒂腐病菌、鐮刀菌屬、藍(lán)莓采后致病菌以及辣椒疫霉菌有較好的抑菌作用。Zhou Ting等[33]研究發(fā)現(xiàn)癸烷精油能夠顯著抑制青霉菌(Penicillium expansum)的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā),從而發(fā)揮抑制青霉病的作用。劉瑞玲等[34]采用體外直接接觸法和體外熏蒸法,研究了香芹酚精油、肉桂精油和百里香精油對(duì)火龍果采后主要病原菌層生鐮刀菌(F. proliferatum)和平頭炭疽菌(Colletotrichum fructicola)的抑制效果,發(fā)現(xiàn)香芹酚精油表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌性,可作為火龍果貯藏前的熏蒸劑。檜木醇從柏科樹木中提取,天然安全,具有良好的抗真菌活性,研究發(fā)現(xiàn)其能抑制灰霉病菌,是良好的食品防腐劑和發(fā)芽抑制劑[35],有持久的抗菌效果,然而,目前關(guān)于檜木醇對(duì)果蔬采后病原菌的抑制作用及可能的作用機(jī)理鮮有報(bào)道。
本研究通過(guò)體外平板抑菌實(shí)驗(yàn),明確了檜木醇溶液對(duì)芋艿采后兩種主要病原菌的抑制作用,50 mg/L的檜木醇溶液能完全抑制鐮刀菌屬真菌的生長(zhǎng),這與Morita等[36]研究結(jié)果一致。同時(shí),100 mg/L檜木醇溶液可完全抑制可可毛色二孢菌的生長(zhǎng)。有文獻(xiàn)報(bào)道,檜木醇可抑制各類腐霉菌的體外菌絲生長(zhǎng)[15],這給本研究結(jié)果提供了理論依據(jù),且研究發(fā)現(xiàn)檜木醇溶液濃度越大對(duì)病原菌的抑制率越大。進(jìn)一步通過(guò)其對(duì)病原菌孢子萌發(fā)、菌絲體脂質(zhì)過(guò)氧化以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響判斷對(duì)病原菌的破壞程度,初探其作用機(jī)理。鐮刀菌屬孢子萌發(fā)受檜木醇在一定程度上的抑制,采用40 mg/L和80 mg/L檜木醇溶液分別處理鐮刀菌屬和可可毛色二孢2 種病原菌,發(fā)現(xiàn)均能使菌的MDA濃度比對(duì)照組的高,表明膜脂過(guò)氧化嚴(yán)重,可能膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)遭到破壞,從而促使細(xì)胞死亡,抑制菌絲的生長(zhǎng)。透射電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)檜木醇破壞菌絲的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),推測(cè)其作用于真菌細(xì)胞膜導(dǎo)致通透性增加,直接接觸線粒體等亞細(xì)胞器,造成其損傷,引起細(xì)胞能量代謝障礙,最終導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡,也進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)論。
近幾年對(duì)檜木醇的研究主要集中于人體醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面的應(yīng)用,而在食品保鮮領(lǐng)域較少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分離鑒定出芋艿采后主要病原菌,并對(duì)檜木醇處理此兩種病原菌的抑制效果進(jìn)行了初步研究,對(duì)進(jìn)一步開發(fā)綠色、安全、高效的芋艿防腐保鮮技術(shù)提供了理論參考價(jià)值,而至于檜木醇的抑菌機(jī)理尚未清晰,還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步闡明。