李鵬飛 廖 奇 陶 楊 魯瓊芬， 王后福 楊仁輝 冷 靜，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

纖維素作為光合作用的主要產(chǎn)物，是自然界中非常普遍和豐富的可再生自然資源[1]。纖維素約占地球總生物量的40%，其中89%左右的纖維素資源未能被開發(fā)利用，存在資源的大量擱淺及能源的浪費(fèi)。通過化學(xué)、物理或者生物技術(shù)將纖維素分解成小分子物質(zhì)，被認(rèn)為是解決當(dāng)前食品短缺、能源危機(jī)、環(huán)境污染和生態(tài)平衡等問題的有效方法[2]。粗飼料中纖維素含量極高，超過其他碳水化合物含量的總和[3]。但動(dòng)物消化道自身不含內(nèi)源纖維素酶，無法直接利用纖維素。研究發(fā)現(xiàn)食草反芻動(dòng)物消化道內(nèi)共生的細(xì)菌、真菌等微生物能夠分泌纖維素酶，可幫助分解纖維素為動(dòng)物提供能量[4]。纖維素酶能夠高效與纖維素分子結(jié)合，破壞纖維素分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，將纖維素分子分解成可被動(dòng)物利用的小分子糖類物質(zhì)。并且在酶促反應(yīng)過程中，不會(huì)產(chǎn)生毒害物質(zhì)以及造成環(huán)境污染。微生物纖維素酶可能會(huì)是解決纖維素資源利用問題最環(huán)保的好辦法。將適量的纖維素酶制劑添加到畜禽飼料當(dāng)中，植物細(xì)胞壁被降解后，可使粗飼料中大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到充分釋放，能夠有效改善飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，便于動(dòng)物對(duì)其進(jìn)行消化和吸收。纖維素酶制劑對(duì)提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益、控制飼料成本等均具有積極作用[5]。國(guó)內(nèi)在篩選纖維素降解菌方面做了大量研究，但降解效率并不理想[6]。本文主要針對(duì)纖維素降解菌的篩選、分離、鑒定和對(duì)飼料纖維降解特性進(jìn)行研究。通過篩選出高活力的纖維素降解菌為纖維素酶制劑的開發(fā)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)羊場(chǎng)采集新鮮的成年綿羊（云南薩福克羊×烏骨綿羊，♂，采食黑麥草青貯料、玉米秸稈青貯料、精料）糞便，于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要儀器

顯微鏡(奧林巴斯）；紫外可見光分光光度計(jì)（上海菁華儀器公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司）；恒溫培養(yǎng)箱（江蘇常州國(guó)華有限公司）；水浴恒溫?fù)u床（江蘇常州國(guó)華有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（江蘇常州國(guó)華有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Sigma公司）；電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.1.3 主要試劑基因組提取試劑盒DNeasy Blood Tissue Kit，購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司；生化材料，購(gòu)自大連寶生物公司；檸檬酸鐵、七水硫酸亞鐵、pNP、pNPG、水楊苷、3,5-二硝基水楊酸、七葉苷、異硫氰酸胍等，購(gòu)自昆明謀好品科生物有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物等，購(gòu)自云科生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的配制參考梁艷琳[7]和董恒[8]方法。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的富集與初篩

取新鮮的羊糞便樣品富集培養(yǎng)后，選取對(duì)羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基降解效果最好的菌株作為研究對(duì)象[9]。

1.2.2 纖維素降解菌的復(fù)篩

將經(jīng)過初篩后獲得的菌株接種于CMC-Na 液體復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、225 r∕min 搖床培養(yǎng)4 d，測(cè)定CMC 酶活力與FPA 酶活力，以酶活力為指標(biāo)篩選目的菌株。參照Senegani等[10]研究方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照Christakopoulos P[11]研究方法繪制pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線。

纖維素酶活力的測(cè)定：運(yùn)用DNS 分光光度法測(cè)定纖維素酶活力，實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟參考有關(guān)資料[12-14]。β-葡萄糖苷酶活力可用比色法測(cè)定[11]，酶活力定義為1 ml 原酶液每分鐘催化底物產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U∕ml）。

1.2.3 菌株對(duì)飼料粗纖維的降解

分別加入3 g過200目篩的黑麥草、麩皮、玉米皮和米糠于4 個(gè)裝有100 ml 的LB 培養(yǎng)液的錐形瓶中，按照2%的比例接種培養(yǎng)液。每種底物設(shè)2個(gè)重復(fù)和一個(gè)未加菌液的空白對(duì)照，于37 ℃、220 r∕min分別培養(yǎng)36 h 后，取2 ml 發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r∕min 離心10 min制備粗酶液，并測(cè)其酶活力。然后將殘?jiān)哭D(zhuǎn)入已恒重的200 目的尼龍袋，參照胡艷平等[15]尼龍袋粗纖維測(cè)定方法檢測(cè)粗纖維的含量。

1.2.4 菌株種屬的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：觀察其菌落與菌體形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

分子學(xué)鑒定：①基因組提取和16S rDNA基因擴(kuò)增基因組DNA提取參照李亞丹[16]、包蕾[17]和Yu等[18]的方法提取[16-18]。利用引物P1-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’和P1-R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’，對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA基因序列的擴(kuò)增[19]。電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符后，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。②16S rDNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。將菌株的16S rDNA序列在NCBI 中進(jìn)行Blast 序列比對(duì)與同源性分析，選出與該序列相似性較高的核酸序列用于系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。從而得到相關(guān)菌株16S rDNA 序列，用Mega 5.0軟件程序中的Neighbor-Joining法進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[20]，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

從新鮮的羊糞便樣品中反復(fù)篩選分離得到36株菌落，其中25 株能夠在羧甲基纖維素鈉功能篩選培養(yǎng)基形成清晰的透明圈，根據(jù)菌株透明圈與菌株直徑比（H∕C）的大小，挑選H∕C 較大的10 株菌落，初步確定此菌株能夠產(chǎn)生纖維素酶，將這10 株菌落分別命名為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10；進(jìn)一步將所篩選到的10株菌株點(diǎn)種在底物為七葉苷的β-葡萄糖苷酶功能篩選培養(yǎng)基平板上，根據(jù)菌株黑色圈與菌株直徑比（D∕C），挑選D∕C 較大的6 株菌落，分別為B2、B3、B4、B5、B8、B10，初步確定此菌株能夠分泌β-葡萄糖苷酶。

根據(jù)羧甲基纖維素鈉功能篩選培養(yǎng)基H∕C 的大?。ū?），挑選出6 個(gè)黑色圈與菌株直徑比（D∕C）較大的菌株B2、B3、B4、B5、B8、B10 作為后續(xù)復(fù)篩的目的菌（表2），接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)后，分別測(cè)定纖維素酶活力，依據(jù)復(fù)篩的結(jié)果，篩選出β-葡萄糖苷酶活力最高的菌株B5 作為后續(xù)研究對(duì)象。

表1 不同細(xì)菌在CMC-Na和七葉苷鑒別培養(yǎng)基上的透明圈∕菌落直徑比值

表2 纖維素酶產(chǎn)生菌復(fù)篩結(jié)果(U∕ml)

2.2 B5菌株對(duì)粗纖維飼料降解

提取分別添加有黑麥草、麩皮、玉米皮和米糠發(fā)酵培養(yǎng)36 h后的粗酶液，按照DNS分光光度法測(cè)定纖維素酶活力以及飼料粗纖維降解率。結(jié)果顯示，在添加麩皮和黑麥草的培養(yǎng)基中纖維素酶活力較高，分別為1 466 U∕ml 和1 293 U∕ml，對(duì)粗纖維降解率分別為34.13%和29.06%，在添加米糠和玉米皮的培養(yǎng)基中纖維素酶活力較低，分別為323 U∕ml 和450 U∕ml，粗纖維降解率為5.78%和7.64%（表3）。相關(guān)性分析顯示，飼料粗纖維的含量與粗纖維降解率、酶活力的相關(guān)系數(shù)分別為0.53和0.546，雙側(cè)顯著性概率值分別為0.47和0.454，在相關(guān)系數(shù)0.01的水平上沒有顯著的相關(guān)性，酶活力與粗纖維降解率的相關(guān)系數(shù)為0.999，雙側(cè)顯著性概率為0.001，雙星號(hào)標(biāo)記表明0.999的相關(guān)系數(shù)在0.01的水平上達(dá)到極顯著，說明二者相關(guān)性很強(qiáng)，并且呈正相關(guān)（表4），驗(yàn)證了圖1直觀結(jié)果。

表3 菌株產(chǎn)酶及對(duì)飼料粗纖維降解率的影響

表4 飼料粗纖維含量、粗纖維降解率和酶活力相互之間的影響

圖1 菌株產(chǎn)酶及對(duì)飼料粗纖維降解率的影響

2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

菌株B5 在LB 平板上37 ℃培養(yǎng)12 h 后，革蘭氏染色呈藍(lán)色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，氣生菌絲與營(yíng)養(yǎng)菌絲分明，并且可以觀察到個(gè)別孢子（圖2a），其菌落為不規(guī)則圓形，菌落中央微凸、菌落有絲狀的紋理、正面白色、干燥、不透明、難以挑?。▓D2b）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落，反面呈現(xiàn)暗灰色（圖2c、2d），初步鑒定為放線菌。

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

2.4 B5菌株基因組DNA提取

提取菌株B5 基因組DNA，電泳檢測(cè)結(jié)果大于20 000 bp，基因組DNA片段為一條單帶，不含有RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)量較好，可以滿足PCR 對(duì)擴(kuò)增模板的要求（圖3）。

圖3 菌株基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.5 B5菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增

以B5菌株基因組DNA為模板，P1-F∕P1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物為一條單帶，大約1 500 bp，與預(yù)期相符（圖4）。

圖4 16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.6 B5菌株16S rDNA序列測(cè)定與分析

序列測(cè)序結(jié)果如圖5，B5 菌株16S rDNA 序列全長(zhǎng)1 585 bp。

圖5 菌株B5的16S rDNA序列

將B5菌株序列提交NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示B5 菌株與鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）同源性達(dá)99%（表5）。

2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用Clustal X2.0 進(jìn)行序列比對(duì)，在進(jìn)化關(guān)系上B5菌株與鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）聚成一簇，同源性高達(dá)99%，初步鑒定B5 菌株屬于放線菌中的鏈霉菌屬成員（圖6）。

3 討論

3.1 產(chǎn)纖維素酶降解菌的篩選與鑒定

眾所周知，在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)棲息著數(shù)量龐大且種類復(fù)雜的微生物菌群，其參與瘤胃纖維的降解，使得反芻動(dòng)物能夠以富含纖維素的牧草為食。因此，反芻動(dòng)物體內(nèi)排出的糞便內(nèi)存在某些高效纖維素降解菌。張慶芳等[21]從西藏黃牛瘤胃液中篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株，被鑒定為燦爛類芽孢桿菌。朱立濤等[22]研究發(fā)現(xiàn)，反芻動(dòng)物依靠瘤胃微生物對(duì)粗纖維的消化率高達(dá)60%。然而未能在消化道內(nèi)利用的粗纖維會(huì)以糞便的形式排出體外，這些難以利用的粗纖維最終會(huì)被微生物降解。趙方圓等[23]從羊的糞便中分離出了一株纖維素降解菌，經(jīng)鑒定為Aspergillus sp. YN1。馬雪姣等[24]通過剛果紅功能篩選法從牛的糞便中篩選到了3株能夠高效降解纖維素的細(xì)菌，繼代培養(yǎng)后分離到一株能夠穩(wěn)定遺傳的菌株。在本研究中，利用剛果紅功能篩選法從綿羊糞便中篩選到B5菌株。B5菌株分泌的纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活力最大，分別為720 U∕ml與670 U∕ml，H∕C與D∕C分別為4.9與2.8。結(jié)果表明，初篩所產(chǎn)生的透明圈與菌落的直徑比（H∕C，D∕C）成正相關(guān)，與姜立春等[6]、胡艷平等[15]、包衍等[25]研究結(jié)果一致。形態(tài)學(xué)分析表明，B5 菌株的菌落為不規(guī)則圓形，正面白色、干燥、不透明、難以挑取，中央微凸，菌落有絲狀的紋理，氣生菌絲與營(yíng)養(yǎng)菌絲分明，革蘭氏陽(yáng)性菌，因此，初步鑒定可能為放線菌。

在本研究中，B5 菌株16S rDNA 基因序列全長(zhǎng)1 585 bp，與鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）同源性高達(dá)99%，初步鑒定B5 菌株屬于放線菌中的鏈霉菌屬。鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）作為自然環(huán)境中最豐富的放線菌，能夠產(chǎn)生多種纖維素分解酶，是參與纖維素降解的重要菌屬[26]。

3.2 菌株B5對(duì)不同飼料粗纖維降解率及酶活力分析

飼料的種類以及飼料中纖維素的種類可能是導(dǎo)致粗纖維降解率差異的原因。本實(shí)驗(yàn)研究了向LB培養(yǎng)基中添加黑麥草、麩皮、玉米皮和米糠對(duì)B5發(fā)酵產(chǎn)酶以及對(duì)粗纖維降解率的影響。在相同的發(fā)酵條件下，添加黑麥草和麩皮的培養(yǎng)基中粗纖維的降解率（29.06%和34.13%）明顯高于玉米皮和米糠（7.64%和5.78%）。加入B5菌株的黑麥草與麩皮所得到的纖維素降解率與宋波等[27]、劉旭[28]的研究相似，他們?cè)诓菔硠?dòng)物糞便與奶牛糞便中篩選到能夠分泌高活性纖維素酶的鏈霉菌，對(duì)牛糞便和秸稈的粗纖維降解率分別為17.8%和31.4%。酶活力分析表明，粗纖維的降解率與酶活力呈正相關(guān)，在添加黑麥草和麩皮的情況下酶活力分別為1 293 U∕ml 和1 466 U∕ml，遠(yuǎn)高于玉米皮（450 U∕ml）和米糠（323 U∕ml）。與胡艷平等[15]研究相同，其使用菌株HY3 發(fā)酵處理麩皮、麥草秸稈和燕麥秸稈，60 h后麩皮的纖維素降解率為7.41%，顯著高于麥草秸稈和燕麥秸稈。但是在相同的發(fā)酵時(shí)間下，本實(shí)驗(yàn)麩皮的纖維素降解率為34.13%，顯著高于胡艷平的結(jié)果。Xiao等[29]研究發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化Neurospo

ra.crassa（粗壯脈紋胞菌）對(duì)茶粕的發(fā)酵條件，在74.9 h后，其粗纖維降解率高達(dá)48.65%。文少白等[30]利用無花果曲霉和康寧木霉對(duì)香蕉莖稈發(fā)酵處理發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的纖維素酶活力分別為699.8 U∕ml和332.02 U∕ml，粗纖維降解率分別為22.39%和20.89%。在本研究中，黑麥草的纖維素含量最高（42.50%），遠(yuǎn)高于麩皮（10.40%）、玉米皮（7.20%）和米糠（7.27%），其粗纖維降解率與麩皮接近，遠(yuǎn)高于玉米皮與米糠。以上研究表明，B5 菌株對(duì)飼料粗纖維降解效率與酶活力顯著相關(guān)，與飼料中纖維素含量相關(guān)性不明顯。

表5 B5菌株16S rDNA同源性比對(duì)

圖6 B5系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論

從綿羊糞便中篩選到25 株纖維素降解菌，并對(duì)其中產(chǎn)酶活力最高的一株細(xì)菌B5 進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示B5菌株屬于放線菌中的鏈霉菌屬。B5菌株對(duì)飼料粗纖維的降解效率與其酶活力顯著相關(guān)，與飼料中纖維素含量相關(guān)性不明顯。