張林靜，陳惠麗，何 黎，黃 芩，韋 燾

（1） 海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科，海南?？?570206；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)教務(wù)處；3） 昆明醫(yī)科大學(xué)圖書館，云南昆明 650500）

出生缺陷是指基因或染色體異常引起的胚胎或胎兒生長發(fā)育過程中出現(xiàn)的脊柱裂、無腦兒、唇腭裂、先心病等功能或結(jié)構(gòu)異常性疾病，我國新生兒出生缺陷率高達5.6%，嚴重影響我國人口出生質(zhì)量[1-2]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是半胱氨酸及蛋氨酸代謝過程中間產(chǎn)物，其濃度與血管內(nèi)皮損傷、不良妊娠結(jié)局及新生兒出生缺陷有密切關(guān)系[3]。葉酸可為Hcy 代謝提供甲基，可作為同型半胱氨酸血癥治療藥物之一[4]。近年發(fā)現(xiàn)[5]，葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性與血清Hcy 濃度升高密切相關(guān)，不同基因型葉酸患者血清Hcy 水平存在明顯差異。目前臨床上發(fā)現(xiàn)在妊前3 個月補充葉酸能有效降低血清Hcy 水平，明顯減少新生兒出生缺陷率，尤其是神經(jīng)管畸形[6]。然而，關(guān)于葉酸利用能力與血清Hcy 的關(guān)系及其最佳補充量目前尚不明確，因此本研究將探討2019年1月至2020年1月在本院婦產(chǎn)科建檔的537例孕婦不同葉酸代謝關(guān)鍵酶基因型對血清Hcy 的影響及補充葉酸對預(yù)防新生兒缺陷的效果，現(xiàn)報告如下。

1 資料及方法

1.1 臨床資料

選取2019年1月至2020年1月在欽州市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科建檔的537例孕婦為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡20～35 歲，單胎、活產(chǎn)孕婦；（2） 入組時為健康孕婦，無不良孕產(chǎn)史、無產(chǎn)科并發(fā)癥；（3） 夫妻雙方無家族遺傳病史；（4） 孕婦依從性良好，能定期接受產(chǎn)檢；（5） 新生兒缺陷參考中華醫(yī)學(xué)會相關(guān)診斷；（6） 所有孕婦均知情同意，愿意配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)： （1）合并肝腎功能不全、嚴重消化系統(tǒng)疾病、冠心病、糖尿病、惡性腫瘤、甲狀腺疾病或免疫系統(tǒng)疾病等；（2） 近期應(yīng)用過影響維生素B12 和葉酸吸收的藥物，如抑酸藥質(zhì)子泵、避孕藥、H2 受體阻滯劑、阿司匹林等；（3） 有過妊娠神經(jīng)管缺陷史；（4） 應(yīng)用過利尿藥、抗癲癇要、煙酸等藥物。

1.2 方法

1.2.1 分組情況在首次產(chǎn)檢時采集孕婦口腔黏膜上皮細胞，采用熒光定量 PCR 測定MTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C 的基因多態(tài)性，根據(jù)各基因位點出現(xiàn)頻率、功能、純合、雜合情況，對葉酸利用能力進行風(fēng)險分級，其中0 級為無風(fēng)險，葉酸利用能力正常；1～2 級為低風(fēng)險，葉酸利用能力略差；3～5 級為中風(fēng)險，葉酸利用能力較差；6～8 級為高風(fēng)險，葉酸利用能力很差，并根據(jù)葉酸利用能力分為A 組（未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險+低風(fēng)險） 及B 組（中度風(fēng)險+高度風(fēng)險），A 組給予葉酸400 μg/d，B 給予葉酸800 μg/d，給藥至孕3個月，孕中期及孕晚期根據(jù)Hcy 值調(diào)整葉酸用量。

1.2.2 PCR 測定葉酸代謝關(guān)鍵酶相關(guān)位點采用由上海生物工程公司設(shè)計的Primer Premier 5 PCR引物。收集孕婦血液樣本，將樣本置于4℃的離心機中以12 000 r/min 離心處理15 min，樣品完成后分為三層，留取上清液并將上清液轉(zhuǎn)移之一1.5 mL EP 管中，注意避免吸到下層沉淀。向上清液中加入等體積異丙醇，充分搖勻攪拌后冷凍靜置10 min。將樣本置于4℃的離心機中以12 000 r/min 離心處理15 min，棄去上清液，EP 管底白色沉淀物為DNA，采用75%的酒精反復(fù)洗滌沉淀物。將樣品置于4℃的離心機中以12 000 r/min 離心處理10 min，棄去上清液，EP 管底白色沉淀物為RNA，室溫下晾干5～10 min。待沉淀物晾干后，采用30～40 μL DEPC 水溶解沉淀物，采用超微量分光光度技測定DNA 含量。各取緩沖液及DNA 混合物2 μL，加入1.5%瓊脂糖凝膠，電壓調(diào)節(jié)至120 V，開始電泳，150 min 后停止，將凝膠曝光于紫外凝膠分析儀中，觀察RNA 條帶，判斷RNA 降解程度，并采用美國ABI 公司7900HT 熒光實時定量PCR 儀 測 定 NMTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C DNA 含量。采用連接酶檢測反應(yīng)（LDR）對基因進行分型，并應(yīng)用Genemapper 軟件對NMTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C 進行基因分型。

1.2.3 血清Hcy 測定分別于服用葉酸前、孕早期、孕中期、孕晚期及產(chǎn)后42 d 在產(chǎn)婦產(chǎn)檢時抽取其靜脈血，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA） 測定患者血清中Hcy 水平，具體操作如下：采集孕婦靜脈血3 mL，以3 000 r/s 離心處理10 min，收集上清液，并置于-80 ℃中保存待測。Hcy 試劑盒購于聚創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司，試劑參考值區(qū)間（0～20 μmol/L）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料比較采用%表示，采用χ2檢驗，計量資料采用（））表示，組間計量資料比較應(yīng)用t值分析，并應(yīng)用受試者特異曲線（ROC） 分析Hcy 對葉酸利用能力的預(yù)測價值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦MTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C基因分型結(jié)果

MTRR 的A66G 基因分型主要為AA、AG；MTHFR 的C677T 基因分型主要為CT、TT；MTHFR 的A1298C 基因分型主要為AA、AC，見表1。

2.2 孕婦MTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C不同基因分型下血清Hcy 水平比較

A66G 中AA 分型Hcy 水平高于AG+GG；C677T 中TT 分型Hcy 水平高于CT+CC；A1298C中AA 分型Hcy 水平高于AG+GG，見表2。

表1 孕婦MTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C 基因分型結(jié)果 ［n（%）］Tab.1 MTRRA66G,MTHFRC677T,A1298C genotyping results of pregnant women ［n（%）］

表2 孕婦MTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C 不同基因分型下血清Hcy 水平比較（）Tab.2 Comparison of serum Hcy levels under different genotypes of MTRRA66G,MTHFRC677T,and A1298C in pregnant women （）

表2 孕婦MTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C 不同基因分型下血清Hcy 水平比較（）Tab.2 Comparison of serum Hcy levels under different genotypes of MTRRA66G,MTHFRC677T,and A1298C in pregnant women （）

2.3 A 組、B 組不同時期血清Hcy 水平比較

并根據(jù)葉酸利用能力分為A 組（未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險+低風(fēng)險） 402例及B 組（中度風(fēng)險+高度風(fēng)險）135例，B 組葉酸補充前血清Hcy 水平高于A 組，而葉酸補充后孕早期、孕中期、孕晚期及產(chǎn)后42天血清Hcy 水平與A 組比較差異不顯著（P＞0.05），見表3。

2.4 兩組新生兒總出生缺陷率比較

兩組新生兒總出生缺陷率比較差異不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

2.5 葉酸補充前孕婦血清Hcy 水平對葉酸利用能力的ROC 曲線分析

經(jīng)ROC 分析可知，血清中Hcy 表達水平＞8.55 μmol/L，ROC 曲線下最大面積（AUC） 為0.796，靈敏性為82.22%、79.63%，見圖1。

表3 A 組、B 組不同時期血清Hcy 水平比較［（），μmol/L］Tab.3 Comparison of serum Hcy levels in groups A and B at different periods ［（），μmol/L］

表3 A 組、B 組不同時期血清Hcy 水平比較［（），μmol/L］Tab.3 Comparison of serum Hcy levels in groups A and B at different periods ［（），μmol/L］

表4 兩組新生兒總出生缺陷率比較［n（%）］Tab.4 Comparisons of the total birth defect rates of two groups of newborns ［n（%）］

圖1 葉酸補充前孕婦血清Hcy 水平對葉酸利用能力的ROC 曲線分析Fig.1 ROC curve analysis of the levels of serum Hcy and folic acid utilization in pregnant women before folic acid supplementation

3 討論

相關(guān)研究指出[7]，血清Hcy 水平升高是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的重要因素之一。Hcy 具有較強的毒性，高濃度Hcy 會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷，刺激血小板增殖并生成血栓，血栓會導(dǎo)致胎盤栓塞，從而阻斷機體吸收營養(yǎng)物質(zhì)及代謝物質(zhì)排出，影響胎兒新陳代謝[8]。此外，血清高濃度Hcy 會導(dǎo)致機體過氧化物及自由基過度分泌，導(dǎo)致細胞及DNA 受損或凋亡[9]。另外，高濃度Hcy 會抑制S-腺苷蛋氨酸分泌，引起DNA 甲基化，影響染色體分裂，從而增加胎兒畸形及生長發(fā)育異常的發(fā)生風(fēng)險[10]。

近年研究發(fā)現(xiàn)[11]，孕婦血清Hcy 升高與機體葉酸利用度不足有關(guān)，而葉酸利用度受葉酸代謝相關(guān)基因關(guān)鍵酶調(diào)控，而MTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C 為葉酸代謝相關(guān)基因關(guān)鍵酶，當(dāng)這三者出現(xiàn)基因多態(tài)性時能明顯減少機體內(nèi)酶活性，導(dǎo)致大量Hcy 積聚在血清中，引起高Hcy血癥。目前臨床上主要通過補充葉酸治療高Hcy血癥，其中妊娠期孕前及孕后3 個月補充葉酸能明顯降低新生兒出生缺陷率已得到了廣泛認可[12]。然而，不同地區(qū)孕婦在服用葉酸后預(yù)防新生兒出生缺陷率方面存在較大的差異[13]。相關(guān)研究指出[14]，MTRRA66G 純合子突變可使酶活性下降35%，而MTHFRC677T、A1298C 雜合子突變會可導(dǎo)致酶活性下降至30%。本研究對537例孕婦MTRRA66G、MTHFRC677T、A1298C 等位點基因型進行分析，結(jié)果顯示，MTRRA66G 基因型GG、MTHFRC677T 基因型TT、1298C 基因型CC 突變頻率依次為5.77%、54.93%、13.04%具有明顯的地域差異，與陳新等[15]認為我國北方地區(qū)葉酸代謝關(guān)鍵酶基因為TT 突變的研究結(jié)果一致。由此可推測，MTHFR 導(dǎo)致的區(qū)域分布差異會影響葉酸利用度，從而導(dǎo)致胎兒出生缺陷率存在差異。本研究結(jié)果顯示，A66G 中AA 分型Hcy 水平高于AG+GG；C677T 中TT 分型Hcy 水平高于CT+CC；A1298C中AA 分型Hcy 水平高于AG+GG，進一步表明葉酸代謝關(guān)鍵酶不同的基因型可影響血清Hcy 表達，進而影響新生兒缺陷率。這結(jié)果也很好解析了我國北方地區(qū)神經(jīng)管畸形發(fā)生率高于南方的現(xiàn)象。

本研究按照葉酸代謝關(guān)鍵酶相關(guān)基因測定結(jié)果分為A 組（未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險+低風(fēng)險） 及B 組（中度風(fēng)險+高度風(fēng)險），結(jié)果顯示，B 組葉酸補充前血清Hcy 水平高于A 組，而葉酸補充后孕早期、孕中期、孕晚期血清Hcy 水平與A 組比較差異不顯著（P＞0.05），且兩組新生兒出生缺陷率無明顯差異。有研究指出[16]，給予高Hcy 血癥育齡女性給予大量葉酸治療后，盡管血清Hcy 水平得到有效的控制，但大量葉酸會導(dǎo)致婦女排卵次數(shù)增加，導(dǎo)致婦女出現(xiàn)多胎妊娠的風(fēng)險，且大量攝取葉酸會引起脂類代謝紊亂，增加血糖濃度，引起心血管疾病。因此，本研究認為，葉酸的補充應(yīng)根據(jù)個體葉酸代謝能力給予個體化用藥指導(dǎo)，以降低大劑量葉酸引起的毒副作用。同時本研究應(yīng)用ROC 曲線分析孕婦補充葉酸前血清Hcy 對葉酸利用度的預(yù)測價值，結(jié)果顯示，血清中Hcy 表達水平＞8.55 μmol/L，ROC 曲線下最大面積（AUC） 為0.796，靈敏性為82.22%、79.63%，這對基層醫(yī)院采用Hcy 評估葉酸利用能力具有指導(dǎo)性意義。

綜上所述，育齡婦女葉酸代謝關(guān)鍵酶基因多態(tài)性與血清Hcy 水平有密切關(guān)系，為不同基因孕婦提供個體化補充葉酸治療可降低新生兒出生缺陷率。但本研究仍存在不足之處，如未對孕婦孕期葉酸變化及膳食對葉酸水平影響進行調(diào)查，因此對于反映葉酸正常代謝的多項指標(biāo)日后仍需要進一步研究。