普 冬，李曉非，余婷婷，王紅英，張潤(rùn)武，李麗華，白 經(jīng)，丁彩梅，李冬玲，楊永銳

（昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650041）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV） 感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝癌和肝硬化的重要因素。一直在我國(guó)人群中具有較高的感染率，據(jù)云南省CDC2016年底的最新調(diào)查，我省年均發(fā)病率為51.99/10 萬(wàn)，昆明市為高發(fā)區(qū)，累計(jì)報(bào)告病例居第一。核苷酸類似物作為HBV 感染的常規(guī)治療藥物之一，面臨一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題，即核苷類似物的耐藥性[1]，耐藥的發(fā)生極大地降低了慢性乙型肝炎患者的治療效果。替諾福韋酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF） 是美國(guó)肝病學(xué)會(huì)（AASLD） 和歐洲肝病學(xué)會(huì)（EASL） 推薦的一線強(qiáng)效抗病毒藥物[2]近年來(lái)，我院部分患者已經(jīng)開(kāi)始使用該藥進(jìn)行治療，因此對(duì)替諾福韋酯耐藥相關(guān)的位點(diǎn)的突變情況，進(jìn)行監(jiān)測(cè)對(duì)慢性乙型肝炎的治療與預(yù)后具有重要的意義?；驕y(cè)序是公認(rèn)的突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)闇y(cè)序檢測(cè)的是乙肝耐藥易突變區(qū)域的完整序列，是判斷病毒核酸堿基突變與否的最直接和最可靠的方法[3]。本研究通過(guò)Sanger 測(cè)序（雙脫氧末端終止法），對(duì)昆明地區(qū)2 707例HBV DNA 陽(yáng)性的慢性乙肝患者，HBV P 基因區(qū)進(jìn)行了測(cè)序和分析，探討TDF 在本地區(qū)慢性乙型肝炎患者中，不同HBV 基因型和替諾福韋酯耐藥相關(guān)的位點(diǎn)的突變情況，及其HBV-DNA 量和HBeAg 之間的關(guān)系。以期為臨床工作者在慢性乙型肝炎使用替諾福韋酯治療方面提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取昆明市第三人民醫(yī)院2017年5月至2019年3月期間，住院及門(mén)診就診的2 707例慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本，男1905例，女802例，年齡14～78 歲，平均46 歲。診斷均符合2015 版《慢性乙型肝炎防治指南》[4]。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 HBV-DNA病毒DNA／RNA 提取試劑盒（磁珠吸附法） 提取試劑盒，購(gòu)自蘇州天隆生物科技有限公司；HBV-DNA 純化試劑盒購(gòu)自西安天隆生物科技有限公司；乙型肝炎病毒分型和耐藥測(cè)序試劑盒購(gòu)自廣州立菲達(dá)安診斷產(chǎn)品技術(shù)有限公司；血清HBsAg 測(cè)定試劑購(gòu)自羅氏診斷公司；血清ALT 定量測(cè)定試劑購(gòu)自該公司；CFX96 自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；3500Dx測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；AU5400 型生化分析儀購(gòu)自日本奧林巴斯公司；M odular E170 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購(gòu)自瑞士羅氏診斷公司。

1.2.2 標(biāo)本采集采集慢性乙型肝炎患者空腹不抗凝靜脈血3 mL，離心10 min，3 000 r/min，分離血清置1.5 mL離心管中，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HBV DNA 定量檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對(duì)乙肝病毒載量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為1×102IU/mL，具體操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 乙肝病毒分型和耐藥基因位點(diǎn)檢測(cè)從血清標(biāo)本中提取乙肝病毒DNA，通過(guò)PCR 擴(kuò)增HBV P 區(qū)RT 段序列，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，在ABI 3500DX測(cè)序儀上直接進(jìn)行Sanger 測(cè)序（雙脫氧末端終止法）。測(cè)序具體操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)序列比對(duì)分析乙肝病毒基因型和HBV P 區(qū)核苷類藥物耐藥相關(guān)位點(diǎn)的突變情況，具體包括：rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250 等。

1.2.5 耐藥位點(diǎn)與不同藥物的關(guān)系：（1）rtM204I/V/S 和rtL180M：為拉米夫定、替比夫定與恩曲他濱的主要耐藥位點(diǎn)；（2） rtA181T/V/S 和rtN236T/V：檢出這兩個(gè)耐藥位點(diǎn)中的任一個(gè)位點(diǎn)陽(yáng)性即可判斷阿德福韋酯耐藥，檢出其它位點(diǎn)視為不確定的、證據(jù)不充分、尚需進(jìn)一步證實(shí)的耐藥位點(diǎn)；替諾福韋酯是比較新的上市藥物，目前還沒(méi)有針對(duì)TDF/TAF 相關(guān)長(zhǎng)期用藥的耐藥研究報(bào)道，但rtN236T/V、A194T 和rt A181T/V 位點(diǎn)突變會(huì)引起替諾福韋酯酯不敏感，是主要的替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)；（3） rtM204 和rtL180M 與（（rtV173L、rt I169T、rtM250V、rtT184/G、rtS202I/G） 5 種突變中的任意一種或兩種組合，就可判斷恩替卡韋耐藥，rtM204V 和L180M 單獨(dú)突變則引起恩替卡韋不敏感。

1.2.6 耐藥敏感性判讀針對(duì)不同藥物的耐藥位點(diǎn)分類及檢出情況，參照《2017年歐洲肝病年會(huì)乙型肝炎病毒感染臨床實(shí)踐指南要點(diǎn)》[5]判讀，見(jiàn)表1。

表1 常見(jiàn)的HBV 基因型耐藥與藥物敏感性Tab.1 Common HBV genotype resistance and drug sensitivity

1.2.7 血清HBsAg 測(cè)定采用瑞士羅氏診斷公司M odular E610 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)血清HBsA g 進(jìn)行測(cè)定，樣品檢測(cè)結(jié)果為：S/CO≥1.0為陽(yáng)性。

1.2.8 血清ALT 定量測(cè)定采用日本奧林巴斯AU5400 型生化分析儀檢測(cè)血清ALT，正常范圍上限為40 U/L。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。比較核苷酸類藥物耐藥標(biāo)本的計(jì)數(shù)，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異慢性乙肝患者基因型發(fā)布情況

本研究2707例慢性乙肝患者中，共有52例（1.92%，52/2707） 患者檢測(cè)到替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)的突變，變異率為1.92%。52例患者中HBV 基因型以C 型為主占65.38%（34/52），B 型次之占34.62% （18/52），D 型沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。B 基因型和C 基因型HBV 感染率分別為34.62%（18/52）和65.38%（34/52），基因型分布與昆明地區(qū)的總體分布一致，昆明地區(qū)HBV 基因型以C 型為主占62.43% （1690/2707），B 型 次 之 占 37.31%（1010/2707），D 型也有發(fā)現(xiàn)占0.26% （7/2707），但與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究報(bào)告[6]比較，本地區(qū)的HBV 基因型分布狀況有獨(dú)立特征。52例替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異的慢性乙肝患者，其基因型和基本資料見(jiàn)表2。

2.2 52例檢測(cè)到替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變的檢出結(jié)果

檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變（A194T、N236T、A181T/V），耐藥不敏感性I（1.92%，52/2707）。其中A181T/V 位點(diǎn)單獨(dú)突變率最高（19.23%），N236T 位點(diǎn)單獨(dú)突變率次之（15.38%），A194T 位點(diǎn)單獨(dú)突變率最低（9.61%）；檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥突變相關(guān)的位點(diǎn)（A194T、N236T、A181T/V） 和次要/ 補(bǔ)償耐藥位點(diǎn)（I169T、M204V/I、L180M 等） 的二個(gè)位點(diǎn)混合突變26例，主要是：A181T/V+N236T，10例（19.23%）；A181T/V+M204V/I，8例（15.38%），同時(shí)也檢出2例三個(gè)位點(diǎn)混合突變，分別為：A181T/V+N236T+V173，1例（1.92%）；A181T/V+M204V/I+L180M，1例（1.92%），見(jiàn)表3。

表2 52例替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異慢性乙肝患者基因型和基本資料Tab.2 Genotype and basic data of 52 chronic hepatitis B patients with tenofovir resistance mutation

表3 52例慢性乙肝患者替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變的檢出結(jié)果Tab.3 The result of tenofovir resistant mutation sites in the 52 chronic hepatitis B patients

2.3 替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異與HBV-DNA量的相關(guān)性分析

對(duì)24例檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關(guān)位點(diǎn)（A194T、N236T、A181T/V） 單獨(dú)突變的慢性乙肝患者，按照HBV-DNA 水平分為：低于檢測(cè)線（＜102IU/mL），低水平（102～104IU/mL）；中水平（105～107IU/mL）；高水平（≥107，IU/mL）4 個(gè)組，各組分別有2例（3.84%）。16例（30.75%），4例（7.69%），2例（3.84%）。替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)單獨(dú)變異在各組間的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。其中HBV-DNA 中，低水平兩組的各耐藥位點(diǎn)的突變檢出率較高。而對(duì)HBV-DNA 中，低水平為102～104IU/mL 和105～107IU/mL 兩組進(jìn)行HBV 耐藥突變差異分析，發(fā)現(xiàn)各耐藥位點(diǎn)在這兩組間的突變檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異檢出率與HBV-DNA 量的關(guān)系［n（%）］Tab.4 The relationship between tenofovir resistance mutation rate and HBV-DNA level ［n（%）］

2.4 不同HBeAg 狀態(tài)下替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)的變異率

替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異與HBeAg 的關(guān)系24例檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關(guān)位點(diǎn)（A194T、N236T、A181T/V） 單獨(dú)突變的慢性乙肝患者中，e 抗原陽(yáng)性者9例（37.50%），e 抗原陰性者15例（62.50%）。替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)A181T/V 變異在HBeAg 陽(yáng)性組的突變檢出率較高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異率與不同HBeAg 狀態(tài)的關(guān)系［n（%）］Tab.5 The relationship between tenofovir resistance mutation rate and HBeAg level ［n（%）］

2.5 不同ALT 狀態(tài)下替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)的變異率

替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異與ALT 的關(guān)系24例檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關(guān)位點(diǎn)（A194T、N236T、A181T/V） 單獨(dú)突變的慢性乙肝患者中，ALT 值超過(guò)正常范圍上限（40 U/L） 者10例 （41.67%），ALT 值屬于正常范圍者14例（58.33%）。替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)A181T/V 變異在ALT 值異常組的突變檢出率較高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異率與不同ALT 狀態(tài)的關(guān)系［n（%）］Tab.6 The relationship between tenofovir resistance mutation rate and ALT level ［n（%）］

3 討論

目前替諾福韋酯治療慢性乙肝患者的療效已得到肯定，被國(guó)內(nèi)外權(quán)威肝病治療指南推薦為慢性乙型肝炎抗病毒治療的一線藥物，因替諾福韋酯作為治療慢乙肝的新藥，其作用機(jī)制及優(yōu)勢(shì)較為顯著[7]，又屬于強(qiáng)效低耐藥基因屏障藥物，目前尚無(wú)明確的耐藥性報(bào)道。雖然口服核苷類治療有明確的抑制HBV 的作用，但由于HBV 復(fù)制過(guò)程中有反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，而反轉(zhuǎn)錄酶不具DNA 聚合酶的3’～5’校正功能，患者長(zhǎng)期使用單種核苷酸類藥物，再加上HBV 復(fù)制很快，極容易引起HBV 針對(duì)此藥物的耐藥突變[8]。而替諾福韋酯作為一種核苷酸類藥物，對(duì)其耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異的發(fā)生，在不同HBV 基因型和HBV—DNAh 載量，以及不同HBeAg 和ALT 狀態(tài)下的情況進(jìn)行調(diào)查分析。

有研究表明[6]，HBV 基因型分布存在一定的地域性差異，我國(guó)南方以B 型為主，北方以C 型為主，D 型主要見(jiàn)于西藏和部分少數(shù)民族地區(qū)。本研究提示檢測(cè)到替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)的突變52例患者中，B 基因型和C 基因型HBV 感染率分別為34.62% （18/52） 和65.38% （34/52），基因型分布與昆明地區(qū)的總體分布一致，昆明地區(qū)HBV基因型以C 型為主占62.43% （1690/2707），B 型次之占37.31% （1010/2707），D 型也有發(fā)現(xiàn)占0.26%（7/2707） 與以上研究結(jié)論相比較，本地區(qū)的HBV 基因型分布狀況有獨(dú)立特征。可能是昆明地區(qū)人口流動(dòng)的增加，傳播途徑特點(diǎn)等因素改變，造成基因型呈多樣化的趨勢(shì)，流行分布正在發(fā)生變化。本研究中D 型也有發(fā)現(xiàn)占0.26%（7/2707），與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究[9]，在新疆、云南和福建發(fā)現(xiàn)了D型分布的發(fā)現(xiàn)一致。目前有研究[10]表明替諾福韋酯對(duì)HBV 基因型B，C 型慢性乙型肝炎的治療效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但也有李火炎等人[11]的研究指出，針對(duì)不同基因型HBeAg 陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者，治療效果也存在一定的差別，本研究提示檢測(cè)到替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)的突變52例患者中，HBV 基因型以C 型為主占65.38%（34/52），這就提示臨床在使用替諾福韋酯治療時(shí)，需要對(duì)其治療效果是否存在差異進(jìn)一步的研究。

本研究中2707例患者中，共有52例（1.92%，52/2707） 患者檢出與替諾福韋酯（TDF）耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變（A194T、N236T、A181T/V），耐藥不敏感性I（1.92%，52/2707），其中A181T/V位點(diǎn)單獨(dú)突變率最高（19.23%），有研究表明，A181T/V 變異病毒對(duì)大部分抗HBV 核苷（酸） 類藥物均呈現(xiàn)一定程度的耐藥性，對(duì)恩替卡韋的敏感性降低12～15 倍[12]，A181T 突變的病毒株對(duì)恩替卡韋仍舊敏感[13]。另有體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，A181T/V 或N236T ADV 耐藥株對(duì)TDF 的敏感性下降3～4 倍[14]。雖然替諾福韋酯尚未發(fā)現(xiàn)耐藥株，但這類突變發(fā)生的比例相對(duì)較高，提示了產(chǎn)生替諾福韋酯耐藥不敏感性（1.92%） 的問(wèn)題，是應(yīng)該引起臨床進(jìn)一步追蹤研究的。另外，檢出A194T位點(diǎn)單獨(dú)突變率最低（9.61%），有研究表明，194位丙氨酸至蘇氨酸的替換（rtAl94T） 與TDF 耐藥相關(guān)[15]，出現(xiàn)該耐藥后對(duì)ETV 仍敏感[16]，與替諾福韋酯（TDF） 耐藥突變相關(guān)的位點(diǎn)（A194T、N236T、A181T/V） 和次要/補(bǔ)償耐藥位點(diǎn)（I169T、M204V/I、L180M 等） 的二個(gè)位點(diǎn)混合突變26例，主要是：A181T/V+N236T，聯(lián)合變異10例，A181T/V+M204V/I，8例，同時(shí)也檢出2例三個(gè)位點(diǎn)混合突變，原因有待進(jìn)一步研究。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，TDF 治療LAM 或LdT 耐藥的患者較ADV 更有效，挽救療法時(shí)TDF 單藥即足夠[17]。然而本研究結(jié)果顯示，相關(guān)替諾福韋酯（TDF） 耐藥位點(diǎn)（A194T、N236T、A181T/V） 的突變，會(huì)導(dǎo)致ETV和TDF 的耐藥不敏感性，這與ISuzuki 等[18]新近研究結(jié)果一致，其報(bào)道一組耐藥CHB 患者聯(lián)合使用ETV+TDF 治療后出現(xiàn)病毒學(xué)了突破，因此臨床對(duì)耐藥患者進(jìn)行TDF 挽救治療時(shí)，需要進(jìn)行密切隨訪和評(píng)估。

替諾福韋酯酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)單獨(dú)變異HBV-DNA 載量的中，低水平兩組的各耐藥位點(diǎn)的突變檢出率較高。與榮海燕等[19]的研究結(jié)果相似，當(dāng)HBV-DNA 量達(dá)到中等水平時(shí)，突變株和野生株形成一種平衡狀態(tài)，突變株檢出率不再發(fā)生變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A181T/V 單獨(dú)突變的檢出率較高，并且主要在HBV-DNA 載量的中，低水平兩組病例中，可能與文獻(xiàn)[20]研究結(jié)果一致，該突變會(huì)引起病毒在肝細(xì)胞內(nèi)的積聚和HBV DNA 載量的下降，這將影響臨床上僅僅依據(jù)血清HBV DNA 水平診斷病毒學(xué)突破的結(jié)果，提示臨床需加強(qiáng)關(guān)注。而對(duì)HBV-DNA 載量的中，低水平為102～104IU/mL 和105～107IU/mL 兩組進(jìn)行HBV 耐藥突變差異分析，發(fā)現(xiàn)各耐藥位點(diǎn)在這兩組間的突變檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但是HBV-DNA 載量呈反復(fù)低水平波動(dòng)的患者，其病理?yè)p傷和預(yù)后都是不可預(yù)料的，現(xiàn)有報(bào)道也很少，未來(lái)需要更關(guān)注此類人群。

檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關(guān)位點(diǎn)（A194T、N236T、A181T/V） 單獨(dú)突變的24例慢性乙肝患者中，e 抗原陽(yáng)性者9例 （37.50%），A181T/V 變異在HBeAg 陽(yáng)性組的突變檢出率較高6例（66.67%），其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），e抗原陽(yáng)性組的總突變檢出率及（TDF） 耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變檢出率與e 抗原陰性組無(wú)顯著差異，表明這兩者不具有相關(guān)性。HBeAg 可以反映HBV 復(fù)制具有傳染性，替諾福韋酯作為一種核苷酸類藥物，其可以有效的抑制乙型肝炎病毒多聚酶，但是與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變的檢出，提示存在替諾福韋酯的耐藥不敏感性，治療效果可能也會(huì)存在一定的差別，李忠斌等[21]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)其它核苷類藥物耐藥的慢性乙型肝炎患者換用替諾福韋酯治療后應(yīng)答欠佳，同時(shí)檢測(cè)到耐藥突變的HBV 突變株在使用替諾福韋酯治療期間仍存在，提出其它核苷類藥物與替諾福韋酯可能存在交叉耐藥位點(diǎn)，因此筆者應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行深入的研究。替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)A181T/V 變異在ALT 值異常組的突變檢出率較高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表6。在平時(shí)的檢測(cè)和診斷中應(yīng)引起足夠重視。

替諾福韋酯屬于新型強(qiáng)效低耐藥基因屏障藥物，被國(guó)際權(quán)威肝病治療指南推薦用于慢性乙型肝炎抗病毒治療的一線藥物，臨床療效卓越，目前尚無(wú)耐藥性報(bào)，并且替諾福韋酯在本地區(qū)尚未廣泛應(yīng)用，缺乏研究資料。本研究使用基因測(cè)序法對(duì)昆明地區(qū)慢性乙型肝炎患者，基因型和替諾福韋酯耐藥相關(guān)位點(diǎn)，進(jìn)行了準(zhǔn)確有效的檢測(cè)，并分對(duì)替諾福韋酯耐藥位點(diǎn)突變與HBV-DNA 載量和HBeAg 之間的關(guān)系進(jìn)行分析研究，了解本地區(qū)慢性乙肝患者替諾福韋酯耐藥突變情況具有獨(dú)立特征，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于應(yīng)用替諾福韋酯治療療效，意見(jiàn)尚不統(tǒng)一，如VAN B0M M E L 等[22]研究得出結(jié)論：在其它核苷類藥物耐藥患者中，替諾福韋酯治療敏感性僅輕度降低，可作為進(jìn)一步被選擇的藥物?？梢?jiàn)，只有通過(guò)更深入研究，才能更加明確替諾福韋酯療效，從而更好地指導(dǎo)臨床制定個(gè)體化抗病毒治療方案，更加關(guān)注治療效果不好的或者是治療反應(yīng)很差的患者，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供有力的客觀依據(jù)。