朱連海， 何長生， 申建偉， 楊丹平， 胡諍贇

(1.上海市松江區(qū)九亭醫(yī)院兒科， 上海 松江區(qū) 201600 2.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院兒科， 上海 松江區(qū) 201600)

毛細支氣管炎是一種下呼吸道感染性疾病，以呼吸道合胞病毒引發(fā)的病毒性毛細支氣管炎最為常見，多發(fā)于2歲以下尤其是2～6個月嬰幼兒群體。由于遺傳、免疫力低、生活環(huán)境差、流行性疾病等影響，近年來病毒性毛細支氣管炎發(fā)病率呈遞增趨勢[1]。病毒性毛細支氣管炎進展極快，年齡小于6個月患兒死亡率高，且治療后多出現(xiàn)哮喘等并發(fā)癥，嚴重影響患兒生存及生活質量[2]。及時診斷和采取有效治療對控制病情發(fā)生發(fā)展，改善患兒預后有重要意義。病毒性毛細支氣管炎發(fā)生發(fā)展與呼吸道合胞病毒和炎癥反應有關。Tao等研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道合胞病毒感染的鼻咽癌患者腫瘤組織中LncRNA MEG3(maternally expressed gene 3，母系表達基因3)低表達，可能通過影響腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素(IL)-8水平，阻止呼吸道上皮細胞感染呼吸道合胞病毒[3]。由于LncRNA MEG3在病毒性毛細支氣管炎發(fā)生發(fā)展中未有研究，本研究通過檢測病毒性毛細支氣管炎患兒外周血單個核細胞和痰液中LncRNA MEG3表達水平，分析其與患兒臨床病理特征及預后關系，探究其臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2017年2月至2019年1月上海市松江區(qū)九亭醫(yī)院和上海市松江區(qū)中心醫(yī)院收治的病毒性毛細支氣管炎患兒103例，其中男性患兒69例，女性患兒34例，年齡4～25個月，平均(12.67±3.85)個月。根據毛細支氣管炎臨床病情嚴重程度分為三組：輕度組41例，中度組35例，重度組27例。納入標準：①均符合病毒性毛細支氣管炎診斷標準。②入組患兒均在患病3d內入院，且2周內無類固醇激素使用史。③臨床及預后資料完整。排除標準：①合并患有先天性心臟病。②有免疫缺陷。③合并肺結核等肺部感染。另選取同期體檢顯示健康嬰幼兒103例為對照組。其中男性71例，女性32例，年齡5～24個月，平均(13.04±4.12)歲。所有入組患兒及健康嬰幼兒家屬均對本研究知情，并簽署知情同意書。本研究經上海市松江區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2主要儀器和試劑:實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：7500，美國ABI公司)；SYBR PrimeScriptTM qRT-PCR試劑盒(批號：RR820a，大連寶生物工程有限公司)；反轉錄試劑盒(Reverse transcriptase Kit，批號：RP1105，北京索萊寶科技有限公司)；RNA提取試劑盒(Trizol Reagent RNA，批號：R1200-100，北京索萊寶科技有限公司)。

1.3方 法

1.3.1樣本采集:入組患兒及健康嬰幼兒分別于入院當天及體檢時抽取外周靜脈血3mL，采用Ficoll-Hypaque分離液分離并獲取外周血單個核細胞(PBMCs)，將細胞數(shù)調整為1×109L-1，在CO2飽和濕度下育孵5h后收集細胞，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。入組健康嬰幼兒采用喉部輕壓刺激法收集痰液。入組患兒于入院當天進行生理鹽水口腔清潔后，常規(guī)拍背吸痰，痰液量較少則給予3%NaCl氧驅霧化吸入15min后重新吸痰，保證收集痰液量≥1.5mL。所收集痰液2h內檢測合格后，加入4倍體積的1%二硫蘇糖醇、等體積磷酸鹽緩沖液，經震蕩、離心后取上清液于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2qRT-PCR法檢測患兒外周血單個核細胞和痰液中LncRNA MEG3表達:采用Trizol法分別提取外周血單個核細胞和痰液總RNA，反轉錄為cDNA后，用于qRT-PCR。qRT-PCR反應體系(20μL)如下：0.8μL上游引物，0.8μL下游引物，2μL cDNA，10μL SYBR Primix Ex TaqTM，0.4μL ROX Dye II，6μL ddH2O，反應程序如下：95℃、33s，1循環(huán)；95℃、5s，62℃、32s，以上40個循環(huán)，一個樣品進行三次重復。采用2-△△CT法計算外周血單個核細胞和痰液中LncRNA MEG3和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) mRNA相對表達量。qRT-PCR引物如表1所示，以GAPDH為內參基因。本實驗與上海徠創(chuàng)生物科技有限公司合作進行。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4隨訪:所有入組患兒經治療出院后，每3個月以電話或復查形式對其進行隨訪，以哮喘發(fā)作為主要終點事件，隨訪至2019年7月截止。

2 結 果

表2 不同患病程度患兒外周血單個核細胞中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕度組比較，#P<0.05；與中度組比較，△P<0.05

2.1不同患病程度患兒外周血單個核細胞中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表達水平比較:對照、輕度、中度和重度組患兒外周血單個核細胞中LncRNA MEG3表達水平依次顯著降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。對照、輕度、中度和重度組患兒外周血單個核細胞中VEGF mRNA表達水平依次顯著升高，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表2。

2.2不同患病程度患兒痰液中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表達水平比較:對照、輕度、中度和重度組患兒痰液中LncRNA MEG3表達水平依次顯著降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。對照、輕度、中度和重度組患兒痰液中VEGF mRNA表達水平依次顯著升高，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表3。

表3 不同患病程度患兒痰液中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕度組比較，#P<0.05；與中度組比較，△P<0.05

2.3患兒外周血單個核細胞中及痰液中LncRNA MEG3與VEGF mRNA水平相關性:如圖1和圖2所示，患兒外周血單個核細胞中及痰液中LncRNA MEG3表達水平與VEGF mRNA表達水平均呈負相關(r=-0.417，P<0.001；r=-0.560，P<0.001)。

2.4不同臨床特征及預后患兒外周血單個核細胞中及痰液中LncRNA MEG3水平比較:不同性別、年齡患兒外周血單個核細胞及痰液中LncRNA MEG3表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。有過敏史患兒外周血單個核細胞及痰液中LncRNA MEG3表達水平顯著低于無過敏史患兒(P<0.05)。治療出院后并發(fā)哮喘患兒外周血單個核細胞及痰液中LncRNA MEG3表達水平明顯低于未并發(fā)哮喘患兒(P<0.05)，見表4。

表4 患兒單個核細胞中及痰液中LncRNA MEG3水平與臨床特征及預后關系

2.5病毒性毛細支氣管炎患兒不良預后影響因素分析:logistic回歸分析可知，有過敏史、VEGF高表達、LncRNA MEG3低表達是影響病毒性毛細支氣管炎患兒發(fā)生不良預后危險因素(P均<0.05)，見表5。

表5 病毒性毛細支氣管炎患兒不良預后影響因素分析

圖1 患兒外周血單個核細胞中LncRNA MEG3與VEGF mRNA水平相關性

圖2 患兒痰液中LncRNA MEG3與VEGF mRNA水平相關性

3 討 論

病毒性毛細支氣管炎常發(fā)生在上呼吸道感染后，表現(xiàn)為持續(xù)性干咳、發(fā)熱、憋喘等，憋喘后患兒病情持續(xù)加重，出現(xiàn)呼氣延長、喘鳴、口周發(fā)青、臉色蒼白、呻吟不止等癥狀。若不能及時治療，疾病可能進展至心力或呼吸衰竭，嚴重威脅患兒生命安全[4,5]。探尋該疾病生物標志物，有助于及時治療和患者預后改善。

LncRNA是長度大于200核苷酸的具有調控功能的非編碼RNA，可參與多種疾病進展。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，下調LncRNA BCYRN1可通過調控氣道平滑肌細胞增殖和遷移能力，抑制哮喘癥進展[6]。Li等在慢性阻塞性肺疾病中研究發(fā)現(xiàn)，下調LncRNA MEG3可抑制支氣管上皮細胞凋亡和自噬[7]。以上研究提示，LncRNA與呼吸道疾病發(fā)生發(fā)展有關。本研究結果顯示，病毒性毛細支氣管患兒患兒外周血單個核細胞和痰液中LncRNA MEG3表達水平明顯低于對照組，提示LncRNA MEG3可能與病毒性毛細支氣管炎發(fā)生有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，輕度、中度和重度組患兒外周血單個核細胞和痰液中LncRNA MEG3表達水平依次顯著降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義，提示LncRNA MEG3可能與病毒性毛細支氣管炎發(fā)展有關。

有研究表明，LncRNA MEG3在皮膚黑色素瘤細胞中表達明顯減少，過表達可抑制黑色素瘤細胞增殖和侵襲能力[8]。Zhang等研究證實，與健康對照組相比，LncRNA MEG3在糖尿病性視網膜患者血清中表達水平顯著降低，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達水平顯著升高，過表達LncRNA MEG3可通過下調VEGF、TGF-β表達抑制糖尿病性視網膜病變發(fā)展[9]。本研究結果顯示，對照、輕度、中度和重度組患兒痰液中VEGF mRNA表達水平依次顯著升高，且患兒外周血單個核細胞中及痰液中LncRNA MEG3表達水平與VEGF mRNA表達水平均呈負相關，提示，LncRNA MEG3可能通過調控VEGF水平，促進支氣管上皮細胞增殖，影響病毒新毛細支氣管炎進展。有研究表明，骨性關節(jié)炎患者軟骨組織中l(wèi)ncRNA MEG3表達水平明顯低于正常軟骨組織，與VEGF表達水平呈負相關，與血管生成和骨性關節(jié)炎發(fā)生過程有關[10]。有研究表明，咳嗽變異性哮喘患兒血清中VEGF高表達，與IL-4、IL-5等炎癥因子表達水平成正相關[11]。提示本研究中，LncRNA MEG3可能通過VEGF，調控炎癥因子水平，影響病毒性毛細支氣管炎發(fā)生發(fā)展。

本研究結果顯示，有過敏史患兒外周血單個核細胞及痰液中LncRNA MEG3表達水平顯著低于無過敏史患兒，提示外周血單個核細胞及痰液中LncRNA MEG3表達水平變化可能與病毒性毛細支氣管炎患兒是否存在過敏史有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，治療出院后并發(fā)哮喘患兒外周血單個核細胞及痰液中LncRNA MEG3表達水平明顯低于未并發(fā)哮喘患兒，且有過敏史、VEGF高表達、LncRNA MEG3低表達是影響病毒性毛細支氣管炎患兒發(fā)生不良預后危險因素，提示LncRNA MEG3可能作為病毒性毛細支氣管炎生物標志物，影響疾病進展及患兒預后。

綜上所述，對照、輕度、中度和重度組患兒外周血單個核細胞和痰液中LncRNA MEG3表達水平依次顯著降低，與VEGF表達水平呈負相關，可能通過調控VEGF表達，影響病毒性毛細支氣管炎發(fā)生發(fā)展及患兒預后。但由于本研究方法較為基礎，樣本量較少，具體機制尚需進一步深入研究。