劉 超， 王明娟， 范彥芳， 單偉超

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學(xué)院， 河北 承德 067000)

盡管人們不斷地研究心梗發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并不斷開發(fā)新的治療方案來限制心肌受損面積和促進(jìn)心梗后心臟功能的恢復(fù)及心室重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)，心肌梗死仍然是造成人類死亡的首要原因[1]。為了挽救即將發(fā)生梗死的缺血心肌，再灌注治療是相當(dāng)有效的方法。然而，再灌注治療也有可能進(jìn)一步導(dǎo)致更多心臟損傷，包括細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管破裂等，甚至有可能進(jìn)一步擴(kuò)大心肌梗死的面積[2]。因此，探究減輕和防止心肌缺血再灌注損傷的方法即分子途徑對于進(jìn)一步改善心梗預(yù)后具有重要意義。丹皮酚(paeonol)是牡丹根皮的主要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可以通過阻礙MAPK/ERK/p38通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[3]。此外，丹皮酚具有顯著的心血管保護(hù)作用。在一項(xiàng)通過Sprague Dawley (SD)大鼠心建立心肌缺血再灌注模型的研究中，丹皮酚被發(fā)現(xiàn)提高了大鼠缺血再灌注后心排出量和左室內(nèi)壓上升段或下降段的最大變化速率，改善了心臟功能[4]。然而，丹皮酚在心肌缺血再灌注過程中發(fā)揮作用的機(jī)制尚未探明。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin1, SIRT1)是編碼基因定位于染色體10q21.3的蛋白質(zhì)。本研究通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后恢復(fù)血流灌注在SD大鼠中建立心肌缺血再灌注損傷模型，以此觀察丹皮酚對心肌缺血再灌注損傷的影響并探究其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物模型:40只雄性SD大鼠均購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，根據(jù)文獻(xiàn)已報(bào)道的方法建立心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)損傷模型[5]。簡言之，所有大鼠吸入2%異氟醚麻醉，于37℃恒溫板上進(jìn)行操作。于無菌環(huán)境下開胸暴露心臟，用7-0縫合線結(jié)扎左心房遠(yuǎn)緣3mm處左冠狀動(dòng)脈40min以造成心肌缺血，以左室前壁心肌顏色變深，并迅速發(fā)展為運(yùn)動(dòng)減退和擴(kuò)張代表心肌缺血建立成功。缺血40min后松開結(jié)扎線120min以恢復(fù)心肌血流灌注，以心電圖顯示抬高的ST段下移一半以上提示再灌注成功。再灌注120min后，獲取大鼠心臟組織和血液樣本。所有大鼠隨機(jī)分為四組，每組十只：①假手術(shù)(sham)組：不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，其余操作與I/R組相同；②I/R組：按照前文的方法建立大鼠體內(nèi)I/R損傷；③丹皮酚組：于建立I/R損傷前24h使用丹皮酚(12mg/kg)灌胃處理；④SIRT1敲低組：于建立I/R損傷前使用丹皮酚灌胃并通過尾靜脈注射SIRT1-siRNA(2.5mg/kg)。本研究實(shí)驗(yàn)方案已獲得本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2Western blot:取大鼠心肌組織樣本，離心后去上清。加入蛋白裂解液(Beyotime Biotcchnology，Shanghai, China)以分離總蛋白。取50g總蛋白加樣于12%聚丙烯酰胺凝膠中，100V電泳2h。然后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(Millipore, Bedford, MA, USA)。用5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，TBST洗膜3次，每次10min，與一抗(Anti-Sirt1抗體，兔抗人多克隆抗體，1∶1000，ab12193, Abcam, Shanghai, China)在4℃下孵育過夜。在TBST洗膜后，在室溫下將膜用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗二抗(山羊抗兔IgG，1∶2000，ab205718, Abcam, Shanghai, China)孵育1h。TBST洗膜3次，每次10 min。最后用Western blot專用試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)顯色成像，采用Image J分析各蛋白灰度值。

1.3活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測:用2,7'-二氯熒光素(DCFDA)試劑盒(Jianchen, Nanjing, China)檢測大鼠心肌組織內(nèi)ROS表達(dá)。

1.4氧化應(yīng)激標(biāo)志物測定:應(yīng)用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA )和試劑盒(Jianchen, Nanjing, China)分別測定SOD和MDA的含量，嚴(yán)格按試劑盒要求操作。

1.5心肌損傷標(biāo)志物檢測:收集大鼠血液樣本，使用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)和肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)檢測試劑盒(Jianchen, Nanjing, China)測定大鼠血漿中LDH和CK表達(dá)水平。

1.6超聲心動(dòng)檢測:經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖采用高分辨率超聲心動(dòng)系統(tǒng)(Visual Sonics, Toronto, Canada)，檢測左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)。

2 結(jié) 果

2.1丹皮酚影響了SIRT1的表達(dá):通過western blot，首先檢測了大鼠心臟組織中SIRT1的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)I/R損傷導(dǎo)致了SIRT1表達(dá)的顯著下調(diào)，丹皮酚則顯著增強(qiáng)了SIRT1的表達(dá)，SIRT1敲低組中SIRT1表達(dá)水平確實(shí)顯著降低了(圖1)。

圖1 丹皮酚對SIRT1表達(dá)的影響

通過western blot檢測各組大鼠心臟組織中SIRT1的表達(dá)水平。**、***分別代表P<0.01、P<0.001

2.2 丹皮酚減輕了大鼠心肌氧化應(yīng)激和心肌損傷:我們初步探究了丹皮酚對受到缺血再灌注損傷的SD大鼠心臟的作用。DCFDA試劑盒的檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠心肌組織中ROS水平明顯增8.8mm。80.4mm(+69.2mm,96.2mm)〗高，丹皮酚則下調(diào)了ROS的含量(圖1A)。通過ELISA，我們進(jìn)一步檢測了大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物和心肌損傷標(biāo)志物含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在I/R處理后，MDA表達(dá)水平顯著增高，SOD則顯著減少，丹皮酚的預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了I/R的作用(圖1B,C)。此外，心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH和CK也因I/R處理而顯著增多，并同樣可以被丹皮酚預(yù)處理逆轉(zhuǎn)(圖1D,E)。此外，與丹皮酚組相比，SIRT1組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)更強(qiáng)、心臟受損更嚴(yán)重(圖1A-E)。我們的發(fā)現(xiàn)提示丹皮酚顯著抑制了缺血再灌注后發(fā)生的氧化應(yīng)激和心肌損傷，且至少在一定程度上是通過SIRT1發(fā)揮作用的。

圖2 丹皮酚對大鼠心肌氧化應(yīng)激標(biāo)志物和心肌損傷標(biāo)志物的影響

(A)通過DCFDA檢測心肌組織中ROS含量。(B,C)通過ELISA試劑盒檢測大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA和SOD的表達(dá)水平。(D,E)通過ELISA試劑盒檢測大鼠血漿中LDH和CK的表達(dá)水平。*、**、***分別代表P<0.05、P<0.01、P<0.001

2.3丹皮酚改善了大鼠心臟重塑、提高了心臟功能:我們通過超聲心動(dòng)圖進(jìn)一步檢測了丹皮酚對于大鼠心臟功能的影響。我們觀察到與I/R組相比，丹皮酚組中大鼠心臟左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室收縮壓(LVSP)顯著增高(圖3A-C)，左室舒張末期壓(LVEDP)則顯著降低(圖3D)。在敲低SIRT1后，與丹皮酚組相比，雖然FS無顯著性差異，但EF和LVSP顯著降低，LVEDP顯著升高(圖3A-D)。結(jié)合前文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為丹皮酚至少在一定程度上通過上調(diào)SIRT1增強(qiáng)了大鼠心肌缺血再灌注后的心臟功能，顯著改善了心室重構(gòu)情況。

圖3 丹皮酚對大鼠心臟功能和心室重構(gòu)情況的影響

(A-D)通過超聲心動(dòng)圖分別檢測大鼠心臟左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室收縮壓(LVSP)和左室舒張末期壓(LVEDP)變化情況。*、**、***分別代表P<0.05、P<0.01、P<0.001；ns代表無顯著性差異。

3 討 論

已有不少研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚在多種心血管系統(tǒng)相關(guān)疾病的進(jìn)程中發(fā)揮了顯著的效果，但對于丹皮酚作用機(jī)制的報(bào)道尚且不多。我們的研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚在缺血再灌注損傷大鼠中通過上調(diào)SIRT1的表達(dá)，抑制了大鼠心肌組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕了心肌損傷，并因此改善了缺血再灌注造成的心室重構(gòu)和心臟功能障礙。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是缺血再灌注造成心肌損傷的重要驅(qū)動(dòng)因素之一，ROS的產(chǎn)生可造成線粒體功能紊亂，引起一系列心肌功能紊亂。如氨磷汀被發(fā)現(xiàn)通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)減少了心肌細(xì)胞凋亡，抑制了心肌的缺血再灌注損傷；脂聯(lián)素被發(fā)現(xiàn)通過激活PKA信號(hào)通路，減少了心肌缺血再灌注損傷中的活性氧產(chǎn)生，對心臟功能具有改善作用[6]。在本研究中，我們觀察到丹皮酚顯著減少了缺血再灌注后大鼠心肌組織中ROS和MDA的含量，同時(shí)促進(jìn)了SOD的產(chǎn)生。心肌損傷標(biāo)志物的測定和超聲心動(dòng)圖的結(jié)果則共同說明丹皮酚的預(yù)處理減輕了I/R造成的心肌損傷。丹皮酚對于氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用已在多種病理過程中有過報(bào)道，提示丹皮酚是治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的潛在選項(xiàng)。如丹皮酚被發(fā)現(xiàn)可以提高小鼠對NO的利用度，減少主動(dòng)脈中ROS的產(chǎn)生，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以此減弱多種心血管疾病中的內(nèi)皮功能障礙[7]；在對乙酰氨基酚造成的肝損傷中，丹皮酚增加了肝臟中SOD、GSH等還原性物質(zhì)的含量，減少了ROS的產(chǎn)生，改善了對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝壞死[8]。結(jié)果證實(shí)了丹皮酚可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、預(yù)防I/R損傷，提示了丹皮酚對于心肌I/R損傷的潛在預(yù)防與治療藥用價(jià)值，并與主流的研究中所報(bào)道的丹皮酚的作用相一致。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)了SIRT1對于抑制炎癥、氧化應(yīng)激的作用。SIRT1主要通過激活Nrf2信號(hào)通路[9]或抑制FOXO家族蛋白的表達(dá)[10]在腦氧化應(yīng)激損傷等多種病理進(jìn)程中抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。在我們的研究中，我們觀察到模型組大鼠心肌組織中SIRT1表達(dá)水平顯著降低，而丹皮酚增強(qiáng)了SIRT1的表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明，敲低SIRT1后丹皮酚保護(hù)心肌的作用被逆轉(zhuǎn)了。這些結(jié)果說明，至少在一定程度上，丹皮酚通過上調(diào)SIRT1減輕大鼠受到的缺血再灌注損傷。我們的研究在表明了丹皮酚的作用機(jī)制的同時(shí)也進(jìn)一步提示了SIRT1在心肌I/R損傷中的保護(hù)作用。SIRT1是一個(gè)具有良好前景的心臟保護(hù)靶點(diǎn)之一，上調(diào)SIRT1在多種心血管疾病中具有保護(hù)作用。在慢性恰加斯心肌病中，通過使用SIRT1激動(dòng)劑，顯著減弱了氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)并改善了心臟功能[11]；薯蕷皂苷則被發(fā)現(xiàn)通過激活SIRT1/Nrf2和p38 MAPK通路減輕氧化應(yīng)激和炎癥以對抗冠心病[12]。我們的研究結(jié)果和主流的研究中SIRT1發(fā)揮的抗氧化應(yīng)激、保護(hù)心肌的功能相同。由于SIRT1抗氧化應(yīng)激和炎癥的作用，提示丹皮酚在其他氧化應(yīng)激或炎癥相關(guān)疾病中可能有類似的作用及作用方式，并很可能通過影響SIRT1下游蛋白如Nrf2和FOXOs等發(fā)揮作用，具有更加廣泛的藥用價(jià)值。然而這還需要進(jìn)一步的探究。

總而言之，我們通過在SD大鼠體內(nèi)構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷的模型，發(fā)現(xiàn)丹皮酚可以通過上調(diào)SIRT1減輕大鼠心肌中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少心肌損傷，改善心臟功能和心室重構(gòu)情況。我們的研究進(jìn)一步闡明了丹皮酚的作用及其作用機(jī)制，為丹皮酚的臨床應(yīng)用和開發(fā)新的缺血再灌注損傷治療方案提供了理論基礎(chǔ)。