喬 芳, 王 寧, 王遠花, 錢明明, 郭 霞, 趙 倩, 田亞娟

(河北省血液中心配型科, 河北 石家莊 050071)

國際輸血協(xié)會(ISBT)命名的人類紅細胞36個血型系統(tǒng)中，Rh血型系統(tǒng)是其中最復(fù)雜的一個，與溶血性反應(yīng)、新生兒溶血病和自身免疫性溶血性貧血等疾病存在重要關(guān)系[1]。Rh血型系統(tǒng)有5種抗原，分別是C、c、D、E、e抗原。其中免疫原性最強的是D抗原，具有非常重要的臨床意義[2]。RhD陰性的個體，在中國人群中約占0.3%～0.5%。RhD變異型定義為用鹽水法檢測為陰性，通過間接抗人球蛋白實驗(IAT)才能檢出的表型。RhD抗原存在多種變異型，根據(jù)其在紅細胞上質(zhì)和量的改變可分為部分D、弱D和Del型。本研究采用陰性確認實驗檢測出RhD變異型，進一步通過基因分型技術(shù)研究RhD變異型中部分D標本的分子背景。通過對河北地區(qū)Rh陰性無償獻血者進行部分D基因型分析，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1對象:2016年期間河北省血液中心漢族無親緣關(guān)系的RhD陰性獻血者，血型血清學鑒定為RhD變異型的個體107例。

1.2血型血清學實驗:三種抗-D血清分別是IgM+IgG抗-D1(IMMUCOR，批號：517097)，IgM+IgG抗-D2(MILLIPORE，批號：BMA1402C)， IgG抗-D3(上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號20150128)、抗-C(上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號：20143005)、抗-c(上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號：20153101)、抗-E(上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號：20153201)和抗-e(上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號：20153302)。

1.3基因組DNA制備:按照TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。TaqDNA聚合酶(PROMAGA，0000175632)；人類紅細胞RhD血型-弱D(部分D)基因分型試劑盒(天津秀鵬生物技術(shù)公司，201603013，201603012)。

1.4RhD基因特異性外顯子的PCR檢測

1.4.1序列特異性引物(sequence specific primers, SSP)擴增：RHD基因特異性引物，對RHD基因特異性外顯子第3、4、5、6、7、9外顯子和內(nèi)對照引物HGH(human growth hormone, HGH)進行基因特異性擴增(見表1)。

1.4.2PCR檢測：PCR反應(yīng)體系總體積10μl，5U/μl GoTaq DNA聚合酶 (Promega, 0000175632)。PCR反應(yīng)條件為95℃ 2min, 94℃ 30s, 55℃ 45s, 72℃ 1min, 35個循環(huán)，最后72℃ 10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈成像并分析結(jié)果。

表1 RHD特異外顯子的PCR-SSP引物序列及擴增產(chǎn)物大小

表2 人類紅細胞RhD血型-部分D基因分型試劑盒擴增參數(shù)

1.5Rh部分D變異型的基因分型(PCR-SSP)：經(jīng)RHD特異性外顯子擴增檢出的Rh部分D變異型的樣本，采用人類紅細胞Rh部分D基因分型試劑盒(天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)進行基因的分型，根據(jù)電泳結(jié)果分型表判讀基因分型結(jié)果。按照試劑說明書要求配制擴增體系，PCR擴增參數(shù)設(shè)置(見表2)。

2 結(jié) 果

2.1血清學分析：經(jīng)IAT確認為D變異型的樣本，用PCR-SSP方法檢測出部分D基因型14例(圖1)。

2.2RhD變異體中Rh表型和RhD外顯子分布：見表3。

表3 Rh因子分型和RhD外顯子分布

2.3RhD變異型中部分D標本的基因型檢測：對檢出的14例部分D的標本進一步應(yīng)用PCR-SSP方法(天津秀鵬生物技術(shù)公司)進行基因分型，結(jié)果為：11例為D cat.VI type3型(圖2)；2例為D cat.Va type2型(圖3)；1例為D cat.IIIc型(圖4)。

圖1 RHD基因第3、4、5、6、7、9外顯子特異性PCR擴增產(chǎn)物

左圖為具有完整特異性RHD基因，右圖為外顯子3、4、5、6缺失

圖2 檢測部分D標本的D cat.VI type3*基因型檢測結(jié)果

圖3 檢測部分D標本的D cat.Va type2*基因型檢測結(jié)果

圖4 檢測部分D標本的D cat.IIIc基因型檢測結(jié)果

3 討 論

Rh血型系統(tǒng)是人類紅細胞中最復(fù)雜的血型系統(tǒng)之一，其重要性表現(xiàn)在Rh血型基因背景的復(fù)雜性和抗原表達的強弱不一等方面。RhD蛋白在紅細胞膜上經(jīng)過12次穿膜，有六個結(jié)構(gòu)域。D變異型分為弱D和部分D；弱D抗原的改變位于細胞膜中和膜內(nèi)，抗原改變表現(xiàn)為只有數(shù)量的改變，卻未發(fā)生質(zhì)的變化；部分D抗原的改變則發(fā)生于細胞膜外，而未發(fā)現(xiàn)抗原的量和質(zhì)的變化[3]。RhD抗原是由RHD基因編碼，該基因位于人類1號染色體短臂；RHD基因和RHCE基因均由10個外顯子組成，是串聯(lián)排列而成，編碼區(qū)長度為1251bp，D基因和CE基因分別編碼417個氨基酸，并組成糖蛋白：即為D抗原和CcEe抗原。

部分D的分子基礎(chǔ)包括三種類型：單個錯義突變、多個錯義突變和RHD/CE融合等位基因[4]。任何原因?qū)е禄虻母淖兙赡茉斐煽乖牡鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。商品化的多種抗-D血清試劑與D抗原結(jié)合的位點不盡相同，與同一抗原決定簇發(fā)生反應(yīng)，它們的結(jié)合強度也會有所不同。因此，不同商品化的抗-D血清試劑與表達D抗原變異型的紅細胞在不同條件下反應(yīng)格局會有所不同[5]。采用PCR-SSP方法對河北地區(qū)檢出的107例D變異型標本進行部分D的基因分型，檢出14例部分D的標本中，11例為D cat.VI type3型，為主要分布的Rh部分D的基因型占78.6%；其他3例基因型中，2例為D cat.Va type2型，約占14.3%；1例為D cat.IIIc型約占7.1%。

RhD變異體中，有研究報道部分D個體易產(chǎn)生抗-D抗體。部分D變異體分6類(DⅡ～DⅦ)，其存在種族和地域多態(tài)性。在非洲或非洲裔人群中，DⅢa和DAR是最易產(chǎn)生抗- D的D變異體；而在高加索人群中，最易產(chǎn)生抗-D的RhD變異體是DⅥ；中國人群中部分D變異型中最常見的基因型是DⅥ[6,7]。DVI型按照RHD基因被RHCE基因替換的位置不同又分為4型，分別為RHD基因缺失D4、D5；缺失D4、D6；缺失D3～6和缺失D3～5外顯子，均是RHD基因和RHCE基因雜交的產(chǎn)物，對應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)分別為D cat.VI type1；D cat.VI type2；D cat.VI type3和D cat.VI type4[8]。本次研究報道的這11例部分D變異體為D cat.VI type3，是RHD基因第3～6外顯子被RHCE基因替換形成的雜交基因。國內(nèi)很少有關(guān)于DVI type 3型產(chǎn)生抗-D抗體的報道，馬印圖等[9]曾報道有1例產(chǎn)生抗-D抗體，且效價達到128的病例。本研究中檢出2例D cat.VI type2型，檢出1例D cat.IIIc型，具有地區(qū)差異性。雖然檢測標本均為健康獻血者，但是對于他們在今后遇到輸血相關(guān)疾病時，即使沒有檢測到抗-D的存在，作為受血者，確定其RhD基因型對于選擇適合的血液產(chǎn)品尤為重要，以盡可能減少免疫抗體的產(chǎn)生而造成輸血困難。因此在臨床輸血實踐過程中，要足夠重視部分D表型為DVI type 3型的患者或孕婦。對于沒有產(chǎn)生抗-D抗體的部分D表型的孕婦，可以在孕期注射抗D免疫球蛋白，使其與新生兒RhD陽性細胞結(jié)合，封閉和抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而達到預(yù)防其產(chǎn)生抗-D的可能性，避免胎兒發(fā)生溶血。

研究D變異型的分子背景，建立簡便準確的基因定型方法，對于血清學檢測方法是有效的補充和完善，從而制定出針對不同個體的輸血策略，對于臨床安全、科學、合理用血以及孕婦、新生兒溶血病的預(yù)防，診斷及治療都有十分重要的臨床意義。