趙 雷, 肖二彬, 梁景衛(wèi), 劉會清, 劉麗娜， 田從哲

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科， 河北 保 定 071000 2.武警河北總隊醫(yī)院耳鼻咽喉科， 河北 石家莊 050081)

MicroRNA(miRNA)是一類長約20～24個核苷酸的微小非編碼RNA，通過其“種子區(qū)”與靶mRNA(messenger RNA)的3'-UTR(3'-untraslated regions)或開放閱讀框以堿基互補(bǔ)配對的方式結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平引起靶mRNA的降解或翻譯抑制[1]。而某些核型miRNA成熟后被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)，并在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以在腫瘤代謝、癌細(xì)胞凋亡、癌細(xì)胞干性維持等諸多方面發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用，包括HNSCC的發(fā)生發(fā)展[2,3]。如miR-205-5p在HNSCC中表達(dá)增高，并通過靶向抑制BRCA1和 RAD17的mRNA水平，從而降低DNA損傷修復(fù)能力并增加染色體不穩(wěn)定[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-655-3p在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、食管鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中表現(xiàn)出抑癌作用，具有重要臨床意義，但目前尚未發(fā)現(xiàn)miR-655-3p在HNSCC中的相關(guān)研究[5～7]。因此，本研究旨在通過系列實驗，初步探索miR-655-3p在HNSCC發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制，為深入探究HNSCC的發(fā)病機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:本研究納入手術(shù)治療的HNSCC患者組織樣本(均未接受放化療)25例，其中男性23例，女性2例；年齡42～67歲，中位年齡56歲；Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期17例；中-高分化18例，低分化7例；13例伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，12例不伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。各樣本切取癌組織(非壞死瘤體組織)及配對癌旁正常組織(距瘤體邊緣0.5cm以上)。樣本收集取得患者書面知情同意。本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:本研究所采用HNSCC細(xì)胞系(FaDu、SCC-9、TU686、TU212)和正常對照細(xì)胞系人支氣管上皮細(xì)胞系(HBE)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，并按細(xì)胞系說明書常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞系轉(zhuǎn)染(miR-655-3p mimics/NC)按照Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)說明書操作步驟完成。

1.2.2總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄:按照RNAprep Pure Tissue Kit和RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit(天根，北京)說明書分別提取組織及細(xì)胞系總RNA。所提取總RNA質(zhì)控合格后，按照miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit和FastKing RT Kit(With gDNase)(天根，北京)說明書分別完成miRNA和mRNA反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3基因相對表達(dá)水平檢測:各組織樣本及細(xì)胞系中miR-655-3p、ZEB1、E-cadherin(CDH1)、N-cadherin(CDH2)、Vimentin相對表達(dá)水平檢測，分別以U6、GAPDH為內(nèi)參照，按照Quant One Step RT-qPCR Kit (SYBR Green)(天根，北京)說明書通過qRT-PCR儀(安捷倫，美國)完成，相對表達(dá)量以2-△△ct計算。相關(guān)引物(表1)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.4MTT細(xì)胞增殖實驗:按照MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit(碧云天，上海)說明書操作步驟，通過酶標(biāo)儀測定570nm波長附近的吸光度，以檢測細(xì)胞增殖能力。

1.2.5Transwell實驗:細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，制備細(xì)胞懸液，每Transwell(8μm)小室(BD，美國)加入4×104個細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24h后，收集、固定并計數(shù)穿透小室基底的細(xì)胞數(shù)(侵襲實驗需提前將小室基底包被基質(zhì)膠)。

1.2.6雙熒光素酶報告基因分析:通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測miR-655-3p的可能靶基因ZEB1及其可能結(jié)合位點，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成報告載體pmirGLO-ZEB1-3'UTR wild-type(Wt)和pmirGLO-ZEB1-3'UTR mutant-type(Mut)，將雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒、miR-655-3p mimics/NC、Wt和Mut按不同分組通過Lipofectamine 2000實現(xiàn)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。進(jìn)一步按照雙熒光素酶報告系統(tǒng)Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，美國)說明書操作步驟，完成各組熒光素酶活性檢測。

2 結(jié) 果

2.1在HNSCC組織及細(xì)胞系中miR-655-3p呈低表達(dá):與配對癌旁正常組織中表達(dá)水平(3.17±0.20)相比，miR-655-3p在HNSCC癌組織中相對表達(dá)水平(2.89±0.17)明顯降低(圖1A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.012。為進(jìn)一步了解miR-655-3p在HNSCC中的表達(dá)趨勢，通過檢索NCBI-GEO DataSets中HNSCC相關(guān)miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)含有miR-655-3p的數(shù)據(jù)集有GSE31277(GPL9770)、GSE32115(GPL14577)。分析發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)集GSE31277中miR-655-3p在HNSCC組織中表達(dá)降低(Fold change=0.52，P=0.013)，而數(shù)據(jù)集GSE32115中miR-655-3p在HNSCC組織中同樣低表達(dá)(Fold change=0.48)，但差異不顯著(P=0.293)(圖1B)。與正常對照細(xì)胞系HBE中表達(dá)水平(0.99±0.03)相比，miR-655-3p在HNSCC細(xì)胞系FaDu(0.79±0.02)、SCC-9(0.51±0.02)、TU686(0.78±0.03)、TU212(0.86±0.03)中表達(dá)水平降低，P<0.05，且各細(xì)胞系表達(dá)水平不同(圖1C)。而細(xì)胞系SCC-9中miR-655-3p表達(dá)水平最低，故用于后續(xù)功能實驗研究。

圖1 miR-655-3p在HNSCC中的表達(dá)情況

2.2miR-655-3p可抑制細(xì)胞系SCC-9的增殖、遷移及侵襲能力:MTT和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，通過miR-655-3p mimics過表達(dá)細(xì)胞系SCC-9中miR-655-3p的表達(dá)，可明顯抑制細(xì)胞系SCC-9的體外增殖、遷移及侵襲能力(圖2)。

圖2 miR-655-3p對HNSCC細(xì)胞功能的抑制作用(**P<0.01)

2.3生物信息學(xué)預(yù)測miR-655-3p可能的靶基因:為探討miR-655-3p可能的抑癌機(jī)制，本研究通過TargetScan、miRDB、miRTarBase三個數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測miR-655-3p可能的靶基因，并通過韋恩圖計算獲得三個數(shù)據(jù)庫共同靶基因22個，進(jìn)一步通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA分析22個靶基因在HNSCC中的表達(dá)情況，篩選出在HNSCC中高表達(dá)的17個(CNBP、ZEB1、MID1、ADAM10、ELK4、SESN3、SLC35F5、ATAD2、SKI、SPIRE1、CAPRIN2、TMEM64、TGFBR2、CANX、ADM、PTP4A1、KPNA6)，低表達(dá)的5個(HIPK3、WEE1、MAGI2、TRPS1、SATB1)。本研究前期實驗發(fā)現(xiàn)miR-655-3p在HNSCC中低表達(dá)，而miRNA可以引起靶mRNA降解，即靶mRNA與miR-655-3p在HNSCC中表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。因此，本研究著眼于高表達(dá)的靶基因。而miRTarBase數(shù)據(jù)庫提示在共同的靶基因中，ZEB1、ADAM10、MAGI2有Luciferase reporter assay、Western blot、qRT-PCR實驗支持，但MAGI2在HNSCC中低表達(dá)，因此ZEB1、ADAM10作為miR-655-3p的靶基因篩選重點。既往研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1作為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的促進(jìn)劑，可促進(jìn)腫瘤惡性表型的進(jìn)展[8]。因此，本研究選擇ZEB1作為miR-655-3p的靶基因進(jìn)行后續(xù)研究。通過qRT-PCR證實ZEB1在HNSCC癌組織中表達(dá)水平(2.04±0.79)高于配對癌旁正常組織(1.66±0.69)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.012(圖3A)，且ZEB1與miR-655-3p在HNSCC組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(R=-0.537，P=0.006)(圖3B)。

2.4miR-655-3p靶向調(diào)控ZEB1的表達(dá):為進(jìn)一步探討miR-655-3p對ZEB1的靶向調(diào)控作用，本研究通過qRT-PCR證實，SCC-9細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-655-3p mimics后，ZEB1表達(dá)水平(0.60±0.06)顯著低于miR-655-3p NC轉(zhuǎn)染后的表達(dá)水平(0.98±0.03)，P=0.001(圖3C)。為證實miR-655-3p與ZEB1的作用關(guān)系，通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測二者的結(jié)合位點(圖3D)，并構(gòu)建pmirGLO-ZEB1-3'UTR wild-type(Wt)和pmirGLO-ZEB1-3'UTR mutant-type(Mut)表達(dá)載體，通過pmirGLO-ZEB1-3'UTR Wt/Mut和miR-655-3p mimics/NC共轉(zhuǎn)染。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，與對照組相比，pmirGLO-ZEB1-3'UTR Wt和miR-655-3p mimics能夠顯著降低熒光素酶活性(P=0.001)(圖3E)。

圖3 miR-655-3p靶向ZEB1調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

2.5miR-655-3p能夠抑制HNSCC細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化:考慮miR-655-3p能夠靶向調(diào)控ZEB1的表達(dá)，而ZEB1是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要促進(jìn)劑，因此本研究推測miR-655-3p能夠抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，而qRT-PCR證實過表達(dá)miR-655-3p的表達(dá)，能夠影響細(xì)胞系SCC-9中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物表達(dá)水平的改變(P<0.01)(圖3F)。

3 討 論

HNSCC是世界上第六位高發(fā)惡性腫瘤，每年大約有650,000新發(fā)病例，并呈上升趨勢，其5年生存率大約50%[9]。因此，深入探究HNSCC的發(fā)病機(jī)制，篩選相關(guān)腫瘤標(biāo)志物或靶向治療的新靶點，對HNSCC的綜合治療具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA 可以通過Notch、WNT/β-Catenin、JAK/STAT或PI3/AKT等多種信號通路，參與腫瘤干細(xì)胞的干性維持，如自我更新、分化、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種惡性表型的生物學(xué)調(diào)控，從而在包括HNSCC在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用[3]。有報道提出，miR-141通過靶向抑制EGFR的表達(dá)，可以抑制HNSCC細(xì)胞的增殖、遷移能力，并誘導(dǎo)其凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-205-5p在HNSCC中通過負(fù)向調(diào)控BRCA1和RAD17 mRNA的表達(dá)，抑制DNA損傷修復(fù)活性并增加染色體不穩(wěn)定，從而抑制腫瘤生長[4]。MiRNA在腫瘤，尤其是在HNSCC中的重要作用，促使我們致力于探究HNSCC發(fā)生發(fā)展中miRNA相關(guān)分子機(jī)制。

既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-655能夠抑制食管鱗狀細(xì)胞癌、上皮源性卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[11]。MiR-655-3p在多種腫瘤中表達(dá)降低并體現(xiàn)出一定程度的抑癌作用，提示其生物學(xué)作用具有泛癌性，可能參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。因此，本研究推測miR-655-3p可能在HNSCC中異常表達(dá)并參與其某種生物學(xué)過程，但目前尚未發(fā)現(xiàn)miR-655-3p在HNSCC中的相關(guān)研究。本研究初步通過qRT-PCR實驗證實miR-655-3p在HNSCC癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)降低，提示miR-655-3p在HNSCC的發(fā)生發(fā)展中可能具有一定的生物學(xué)作用，而細(xì)胞功能學(xué)實驗證實miR-655-3p能夠抑制HNSCC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，與既往研究中報道m(xù)iR-655-3p的生物學(xué)特性一致。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，通過生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-655-3p通過靶向抑制ZEB1 mRNA的表達(dá)，抑制HNSCC細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，從而抑制其惡性表型的進(jìn)展。

綜上，本研究初步探討了miR-655-3p在HNSCC中表達(dá)降低，并通過靶向抑制ZEB1的表達(dá)，進(jìn)而抑制HNSCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程。本研究進(jìn)一步豐富了HNSCC中miRNA相關(guān)機(jī)制研究，為HNSCC的標(biāo)志物篩選及靶向治療具有一定的參考意義。