王文芮,李海燕,常江,2

1.上海交通大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 (上海，200030) 2.中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所 (上海，200050)

0 引言

近年來，隨著對炎癥反應(yīng)在組織修復(fù)過程中的重要作用認(rèn)識日益加深，開發(fā)具有良好免疫調(diào)節(jié)功能的生物活性材料成為了再生醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而設(shè)計(jì)開發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)功能的新型組織再生生物活性材料的重要依據(jù)之一是闡明材料對巨噬細(xì)胞良好的調(diào)控作用及其機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)中，由于人類原代巨噬細(xì)胞獲取困難，難以擴(kuò)增且成本高昂[1]，因此通常利用佛波酯 (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate,PMA) 將人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞THP-1誘導(dǎo)分化為M0型巨噬細(xì)胞。但是，以往文獻(xiàn)報(bào)道的PMA刺激條件并不一致且存在較大差異，PMA濃度從5 ng/mL到400 ng/mL不等[2-6]，而刺激時(shí)間則從3 h到72 h不等[1,6-8]。因此，為了篩選并優(yōu)化誘導(dǎo)THP-1分化為M0型巨噬細(xì)胞使用的PMA刺激條件，本研究在目前報(bào)道較多的PMA濃度范圍 (25～100 ng/mL) 和刺激時(shí)間范圍 (24～72 h) 內(nèi)，比較分析了不同刺激條件對THP-1細(xì)胞的形態(tài)變化、貼壁程度、M0型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物以及M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的影響，并最終獲得較優(yōu)化的PMA濃度和刺激時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1細(xì)胞(ZQ0086)和RPMI-1640完全培養(yǎng)基(ZQ-206)購自上海中喬新舟生物科技有限公司；佛波酯購自Sigma-Aldrich公司(P1585)；CCK-8試劑盒(C0038)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；流式抗體Anti-Human CD11b PE(12-0118-42)購自eBioscience公司；RNA提取試劑盒(E.Z.N.A Total RNA kit I)購自O(shè)MEGA Bio-tek公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace-α kit)和PCR定量熒光試劑(SYBRGreen Realtime PCR Master Mix)購自Toyobo公司；實(shí)驗(yàn)使用的引物均合成自生工生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

用6～8 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基將THP-1細(xì)胞懸浮在T25培養(yǎng)瓶中，并放置于37 ℃/5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天向瓶中加入1～2 mL 新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)8×105～1×106cells/mL時(shí)進(jìn)行傳代。在篩選和優(yōu)化PMA刺激時(shí)間時(shí)，用2 mL含有50 ng/mL PMA的RPMI-1640完全培養(yǎng)基將THP-1細(xì)胞以1×106cells/well 的密度接種于6孔板，分別誘導(dǎo)分化0、24、48、72 h，其中0 h為對照組。在篩選和優(yōu)化PMA濃度時(shí)，在同一刺激時(shí)間下分別用2 mL含有0、25、50、75、100 ng/mL PMA的RPMI-1640完全培養(yǎng)基將THP-1細(xì)胞以1×106cells/well 的密度接種于6孔板，其中0 ng/mL為對照組。

1.2.2 細(xì)胞貼壁程度檢測

將THP-1細(xì)胞以2.5×105cells/well 的密度接種于24孔板，用50 ng/mL PMA刺激0、24、48和72 h，或用0、25、50、75、100 ng/mL PMA刺激48 h或72 h，每組設(shè)置三個(gè)平行重復(fù)樣品。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)棄去孔內(nèi)的舊培養(yǎng)基，用DPBS洗細(xì)胞2次后，向每孔加入320 μL CCK-8工作液 (CCK-8:RPMI-1640=1:10)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)2 h。2 h后吸取24孔板每孔中的溶液分3次加入到96孔板的孔中，每孔加入100 μL。用酶標(biāo)儀檢測樣品溶液在450 nm處的吸光值 (OD value)，以O(shè)D value來間接表征細(xì)胞的貼壁程度。

1.2.3 流式細(xì)胞分析

按照1.2.1所述方法在6孔板中將THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)分化，每組設(shè)置三個(gè)平行重復(fù)，誘導(dǎo)完成后用細(xì)胞刮板將待測細(xì)胞輕輕刮下，800 r/min離心3 min后棄上清液，用DPBS將細(xì)胞洗3次，接著用1 mL 1% BSA-DPBS溶液將細(xì)胞重懸，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中封閉30 min，800 r/min離心3 min棄去上清液，隨后加入100 μL抗體工作液 (抗體：0.5% BSA-DPBS=5：95)，在4 ℃冰箱中避光孵育30 min，然后用DPBS將細(xì)胞洗1次，最后用600 μL DPBS重懸細(xì)胞，在流式細(xì)胞分析儀 (FACS AriaII,BD) 上進(jìn)行檢測，并利用FlowJo V10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 熒光定量PCR

按照1.2.1所述方法在6孔板中將THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)完成后用RNA提取試劑盒提取待測細(xì)胞的總RNA，并用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將待測細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將待測樣品加入384孔板中，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，在PCR儀 (7900 Real-time PCR system,Applied Biosystems) 中進(jìn)行定量檢測，反應(yīng)程序設(shè)置為：1) 95 ℃ 1 min；2) 95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；3) 95 ℃ 15 s；4) 60 ℃ 15 s。利用ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)使用的引物序列如表1所示。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Student’s t test對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，*P<0.05或**P<0.01時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異，n.s.表示無顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 PMA刺激時(shí)間和濃度對THP-1細(xì)胞形態(tài)和貼壁程度的影響

圖1(a)顯示，用50 ng/mL PMA刺激THP-1細(xì)胞時(shí)，THP-1細(xì)胞逐漸由懸浮的體積較小、透亮的圓形細(xì)胞變?yōu)橘N壁的體積較大、中心較暗的圓形或橢圓形細(xì)胞，且貼壁細(xì)胞的體積隨PMA刺激時(shí)間增加而增加。同時(shí)，從圖1(b)可以看出，THP-1細(xì)胞的貼壁程度隨PMA刺激時(shí)間增加而增加，但當(dāng)刺激時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，THP-1細(xì)胞的貼壁程度與48 h時(shí)沒有顯著性差異，表明使用50 ng/mL PMA刺激48 h可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞全部貼壁，且當(dāng)刺激時(shí)間延長至72 h時(shí)，已貼壁的細(xì)胞仍能穩(wěn)定維持貼壁狀態(tài)。圖2(a)顯示，當(dāng)刺激時(shí)間為48 h時(shí)，75 ng/mL和100 ng/mL組的貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯更多，且細(xì)胞明顯體積更大，但這兩組細(xì)胞形態(tài)之間沒有明顯差異。此時(shí)，圖2(b)顯示THP-1細(xì)胞貼壁程度隨著PMA濃度增加而增加，且當(dāng)PMA濃度為100 ng/mL時(shí)，細(xì)胞貼壁程度最高。如圖2(c)顯示，當(dāng)刺激時(shí)間為72 h時(shí)，各組貼壁細(xì)胞體積相比于48 h時(shí)均有所增大，且75 ng/mL和100 ng/mL組的貼壁細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞體積也相對更高，而這兩組細(xì)胞形態(tài)之間仍沒有明顯差異。此時(shí)，圖2(d)顯示，當(dāng)PMA濃度為75 ng/mL和100 ng/mL時(shí)，THP-1細(xì)胞貼壁程度均為最高，且二者之間沒有顯著性差異。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在75 ng/mL 72 h或100 ng/mL 72 h PMA刺激下，THP-1細(xì)胞能達(dá)到最高的貼壁程度，且呈現(xiàn)良好M0型巨噬細(xì)胞形態(tài)，因此初步篩選72 h作為優(yōu)化的刺激時(shí)間。但是，由于這兩種PMA濃度對THP-1細(xì)胞的形態(tài)和貼壁程度的影響之間沒有顯著性差異，因此需進(jìn)一步探究這兩種PMA濃度對THP-1細(xì)胞中M0型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物以及M1和M2極化相關(guān)基因表達(dá)的影響，以篩選出二者之間更優(yōu)的PMA濃度。

圖1 PMA刺激時(shí)間對THP-1細(xì)胞形態(tài)和貼壁程度的影響Fig.1 Effects of PMA stimulation time on morphology and adherence of THP-1 cells

圖2 PMA濃度對THP-1細(xì)胞形態(tài)和貼壁程度的影響Fig.2 Effects of PMA concentration on morphology and adherence of THP-1 cells

2.2 PMA濃度對M0型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的影響

圖3(a)-(b)顯示，相比于正常THP-1細(xì)胞，用75 ng/mL和100 ng/mL PMA刺激72 h后THP-1細(xì)胞的大小和顆粒度明顯增加，且M0型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD11b的表達(dá)量由15.6%±0.4%分別增加至73.8%±4.7%和83.2%±0.4%(P<0.01)，表明大部分THP-1細(xì)胞已被成功誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，但兩種PMA濃度對CD11b表達(dá)的影響之間沒有顯著性差異。同時(shí)，圖3(c)顯示，用75 ng/mL和100 ng/mL PMA刺激THP-1細(xì)胞72 h時(shí)，THP-1細(xì)胞中CD11b的基因表達(dá)分別上調(diào)至32.2±2.8倍(P<0.01) 和55.5±17.6倍(P<0.01)，但兩種PMA濃度對CD11b基因表達(dá)的影響之間也沒有顯著性差異。

圖3 PMA濃度對M0型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD11b表達(dá)的影響Fig.3 Effects of PMA concentration on the expression of M0 macrophage surface marker CD11b

2.3 PMA濃度對M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的影響

圖4顯示，用75 ng/mL或100 ng/mL PMA誘導(dǎo)THP-1分化為M0型巨噬細(xì)胞時(shí)，均顯著增強(qiáng)了M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因IL-6、IL-1β、CD86以及M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因IL-10、CD163、CD206的表達(dá)。其中，在75 ng/mL PMA刺激下，各基因表達(dá)的上調(diào)水平分別為IL-6(5.5±2.3倍)、IL-1β(273.2±3.3倍)、CD86(18.9±3.4倍)、IL-10(5.8±2.2倍)、CD163(258.5±13.0倍)、CD206(7.3±1.7倍)；在100 ng/mL PMA刺激下，各基因表達(dá)的上調(diào)水平分別為IL-6(8.7±1.6倍)、IL-1β(561.8±115.2倍)、CD86(24.6±0.8倍)、IL-10(12.9±1.6倍)、CD163(448.4.1.0±235.4.0倍)、CD206(10.9±1.3倍)，而100 ng/mL PMA刺激對IL-1β、CD86、IL-10和CD206的等基因表達(dá)的增強(qiáng)作用分別是75 ng/mL PMA作用效果的2.05±0.4倍、2.45±0.91倍、1.52±0.2倍和1.33±0.19倍。

圖4 PMA濃度對THP-1細(xì)胞中M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of PMA concentration on the gene expression of M1 and M2 macrophages markers in THP-1 cells

3 討論

在設(shè)計(jì)開發(fā)具有良好免疫調(diào)節(jié)功能的組織修復(fù)生物活性材料的過程中，需要通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來研究材料對巨噬細(xì)胞的影響及其調(diào)控機(jī)制，而盡管THP-1細(xì)胞已在體外研究中被廣泛用于建立巨噬細(xì)胞模型，但標(biāo)準(zhǔn)化PMA誘導(dǎo)方案的缺乏不利于保證研究之間的一致性和可重復(fù)性，因此針對現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的PMA刺激條件進(jìn)行比較和優(yōu)化對建立有效、穩(wěn)定的THP-1人源巨噬細(xì)胞模型至關(guān)重要。既往一些研究由于篩選PMA刺激條件的標(biāo)準(zhǔn)過于單一，例如僅根據(jù)THP-1細(xì)胞的貼壁程度和形態(tài)特征來選擇優(yōu)化的刺激條件[9]，其結(jié)果缺乏一定的說服力。Park等[6]曾較為系統(tǒng)地從細(xì)胞貼壁程度、表面標(biāo)志物表達(dá)、細(xì)胞因子表達(dá)等多個(gè)方面對PMA濃度進(jìn)行了優(yōu)化，并提出使用5 ng/mL PMA刺激THP-1細(xì)胞48 h即可穩(wěn)定地誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞，但由于5 ng/mL PMA遠(yuǎn)低于大多文獻(xiàn)報(bào)道的PMA濃度，并且有研究人員發(fā)現(xiàn)使用5 ng/mL PMA 刺激48 h后，僅能使約60%的THP-1細(xì)胞貼壁[10]，與Park等報(bào)道的90%貼壁率并不相符，因此本研究選擇在目前報(bào)道較多的PMA濃度(25～100 ng/mL)和刺激時(shí)間(24～72 h)內(nèi)通過比較分析不同PMA刺激條件對細(xì)胞形態(tài)、貼壁程度、M0型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物以及M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的影響來對PMA刺激條件進(jìn)行綜合優(yōu)化。研究結(jié)果顯示，當(dāng)PMA刺激時(shí)間為72 h，PMA濃度為75 ng/mL或100 ng/mL PMA時(shí)，THP-1細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)全部貼壁并呈現(xiàn)良好的M0型巨噬細(xì)胞形態(tài)，但75 ng/mL和100 ng/mL PMA會在誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為M0型巨噬細(xì)胞的同時(shí)顯著增強(qiáng)細(xì)胞中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因IL-6、IL-1β和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因CD206的表達(dá)，且100 ng/mL PMA對IL-1β和CD206等基因表達(dá)的增強(qiáng)作用比75 ng/mL PMA更強(qiáng)，與前期研究報(bào)道的高濃度PMA能顯著上調(diào)某些M1和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果相似[6,10]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)75 ng/mL和100 ng/mL PMA也能顯著增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因CD86和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因IL-10和CD163的表達(dá)。Park等[6]曾提出高濃度PMA刺激可能會造成某些基因過度上調(diào)，從而導(dǎo)致外部微弱刺激對巨噬細(xì)胞基因產(chǎn)生的影響被覆蓋，而盡管本研究未對不同濃度PMA刺激引起的M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)上調(diào)是否會影響由于THP細(xì)胞分化而來的M0型巨噬細(xì)胞對炎癥介質(zhì)的響應(yīng)進(jìn)行更深入的探究，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣提示高濃度的PMA刺激可能會增加M0型巨噬細(xì)胞向M1或M2型巨噬細(xì)胞極化以及影響巨噬細(xì)胞對外部刺激響應(yīng)的可能性。而考慮到在研究材料對巨噬細(xì)胞影響及其調(diào)控機(jī)制時(shí)，材料信號對巨噬細(xì)胞極化行為的影響是一項(xiàng)重要的研究內(nèi)容，若巨噬細(xì)胞模型因受到過度PMA刺激而處于不同極化狀態(tài)或無法準(zhǔn)確響應(yīng)材料信號刺激，可能會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在本研究比較分析的PMA刺激條件范圍內(nèi)，當(dāng)PMA濃度為75 ng/mL，作用時(shí)間為72 h時(shí)，既能有效誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為M0型巨噬細(xì)胞，又能對THP-1細(xì)胞內(nèi)M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)產(chǎn)生較低的上調(diào)作用，更適合作為誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為M0型巨噬細(xì)胞的PMA刺激條件。