馬麗麗，楊玲玲，楊海燕，黎跳寧

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏 銀川；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室，寧夏 銀川）

0 引言

隨著腫瘤患者的治愈率和存活率的逐漸提高，放化療引起的卵巢早衰（POF）嚴(yán)重影響育齡女性腫瘤患者的生殖及心理健康。目前尚無有效的治愈辦法。近年來，外源性間充質(zhì)干細(xì)胞( MSC) 療法為包括POF 在內(nèi)的各種難治性疾病帶來了希望。國內(nèi)外研究證實MSCs 攜帶的外泌體（exosomes）能夠進入體內(nèi)減輕組織損傷程度，促進受損組織的修復(fù)，是干細(xì)胞領(lǐng)域具有重要研究價值的新興熱點。本研究通過對POF 模型大鼠腹腔注射人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（human placenta derived mesenchymal stem cells，hpMSCs）外泌體，檢測POF 大鼠卵巢功能，分析 hpMSCs 外泌體對大鼠卵巢功能的修復(fù)作用，為臨床治療POF 提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗選擇具有正常動情周期的SPF 級 SD 雌性大鼠60 只，10 周齡，體重200-220g。胎牛血清（Hyclone公司），exoEasyMaxiKit（德國 QIA-GEN 公司），ELISA試 劑盒購自R&D 公司，蘇木精染色試劑盒（北京博奧森生物有限公司），其他試劑購自sigma 公司。

1.2 實驗方法

按照實驗室常規(guī)程序，SD 大鼠每日腹腔注射環(huán)磷酰胺，腔注射環(huán)磷酰胺首劑量為50mg/kg，維持劑量為8mg/kg，連續(xù)注射 14ds，建立 POF 模型組。

實驗分為對照組，模型組和hpMSCs-EXO 治療組。模型建造成功后，hPMSC-EXO 治療組腹腔內(nèi)隔日注射 150ug 外泌體蛋白（約 1×106hPMSC 產(chǎn)生），2周處死檢測各種指標(biāo)。

1.3 外泌體的提取與鑒定

培養(yǎng)P3 代hpMSCs 細(xì)胞融合至70-80% 時，更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。取 10mL培養(yǎng)上清，采用 ExoQuickTM 按5:1 比例提取 Exosome；BCA 蛋白定量試劑盒檢測 Exosome 蛋白含量；透射電鏡下觀察Exosome 的形態(tài)。

1.4 卵巢功能的測定

1.4.1 ELISA 法測定血清激素

取各組大鼠眶靜脈血，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒測定各組大鼠血清 FSH 和E2 的濃度。按照儀器靈敏度和批間、批內(nèi)變異系數(shù)測定各組樣本，經(jīng)儀器得出讀數(shù)，于標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出相應(yīng)的濃度。

1.4.2 HE 染色法

頸椎脫位法處死大鼠，取卵巢，收集的卵巢經(jīng)4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片常規(guī)蘇木素- 伊紅（HE）染色，觀察卵巢組織及卵泡的形態(tài)，同時在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)各個時期的卵泡數(shù)量，進行比較。

1.4.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HpMSCs 外泌體透射電鏡下形態(tài)及蛋白表達(dá)

透射電鏡下觀察 Exosome 呈圓形或橢圓形的膜性小囊泡，大小不一，包膜完整，直徑30～100nm，囊泡內(nèi)有低密度電子存在，其周圍有類脂膜性結(jié)構(gòu)（圖1）。經(jīng)Western Blotting 分析后，hpMSCs 外泌體表達(dá)表面抗原標(biāo)記物CD9、CD63 等，不表達(dá)Lamp1（溶酶體標(biāo)志物）和Calnexin（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物），說明本研究提取的外泌體，無溶酶體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分（圖2）。

圖1 透射電鏡下 Exosome 形態(tài)(×25000)

圖2 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及exsomes 相關(guān)標(biāo)記物的 Western Blotting 條帶圖注：a 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；b 提取出的exsomes

2.2 HpMSCs 移植前后大鼠血清FSH、 E2 測定

HpMCs-EXO 治 療 組 FSH 明 顯 低 于 模 型組（P＜0.05），E2 值明顯高于模型組（P＜0.05），二者與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。表明治療組FSH、 E2 值均接近對照組水平。見表1。

表1 各組大鼠血清FSH、E2 水平

2.3 hpMSCs 移植前后各組卵巢卵泡計數(shù)

由表2 可以看出，相比POF 模型組，hpMCs-EXO治療組卵巢內(nèi)各級卵泡數(shù)目均有明顯增加，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠卵巢卵泡計數(shù)比較

2.4 卵巢結(jié)構(gòu) HE 染色

HE 染色結(jié)果顯示，hpMSCs-EXO 治療組可見各級卵泡，成熟卵泡存在，見間質(zhì)纖維化，壞死；未移植組結(jié)構(gòu)混亂，有閉鎖卵泡存在，組織開始纖維化，壞死（見圖 3）。

圖3 卵巢HE 染色（×400）（a POF 組 b hpMSCs 治療組）

3 討論

干細(xì)胞移植治療越來越多的被應(yīng)用于改善及治療某些疾病。hPMSCs 目前證實是干細(xì)胞的最佳來源。相較于其他干細(xì)胞，hPMSCs 具有來源方便，細(xì)胞數(shù)量充足，易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化，傳代擴增30 多代后仍具有干細(xì)胞特性。研究證明[1-2]：hPMSC 分泌的細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 和胰島素樣生長因子(IGF) 等可抑制已受損靶細(xì)胞的凋亡，修復(fù)已受損的組織細(xì)胞。NaYi[3]等研究報道hPMSC 可以使Akt 磷酸化，激活PI3K/Akt 信號通路，減少POF小鼠卵巢中顆粒細(xì)胞凋亡，從而改善卵巢功能。另有實驗結(jié)果顯示[4-5]，hPMSC 在體內(nèi)外能抑制化療藥物誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，通過分泌抗氧化物質(zhì)修復(fù)化療所致卵巢損傷，部分改善卵巢發(fā)育微環(huán)境及內(nèi)分泌功能，之后發(fā)現(xiàn)給環(huán)磷酰胺所致POF 的大鼠移植hPMSCs 后，可通過SIRT1/PGC1-a/Nrf2 信號通路激活，改善卵巢內(nèi)分泌的功能，減少卵巢纖維化，提高卵巢抗氧化功能[6]。但與正常的卵巢功能還存在一定差距。

近年來有關(guān)細(xì)胞分泌的外泌體(exosomes)的功能和作用機制的研究已成為熱點。exosomes 是一類直徑在30-100nm，含有RNA 和蛋白質(zhì)的囊泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，存在于機體幾乎所有的體液中。SUN L 等[7]研究發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC)分泌的外泌體可以融入順鉑損傷的卵巢顆粒細(xì)胞，通過上調(diào)抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白 Bax 表達(dá)，加速卵巢功能的恢復(fù)。Xiao 等[8]報道在化療藥物導(dǎo)致的POF大鼠模型中，來源于羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體，富含miR-146a 和 miR-10a 兩種 microRNA（miRNAs），其中miR-146a 通過下調(diào)Irak1 和traf632 表達(dá)，miR-10a通過抑制Bim 表達(dá)，下調(diào)Caspase-9 表達(dá)，從而抑制顆粒細(xì)胞凋亡和減少卵泡閉鎖，恢復(fù)損傷卵巢的功能。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[9]人羊膜上皮細(xì)胞(hAEC) 外泌體通過轉(zhuǎn)移功能性miRNA（如miR-1246）抑制化療誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡,恢復(fù)POF 小鼠卵巢功能。

目前尚無hpMSCs 外泌體對POF 大鼠卵巢功能修復(fù)的研究報道。本實驗用hpMSCs 外泌體移植修復(fù)化療損傷大鼠卵巢，結(jié)果顯示卵巢內(nèi)各級卵泡數(shù)目均有明顯增加，證實了hpMSCs 外泌體能夠通過旁分泌的方式發(fā)揮對化療所致卵巢損傷的保護作用。但外泌體究竟通過何種機制發(fā)揮其改善卵巢功能的生物學(xué)效應(yīng)，需要后續(xù)進一步的實驗研究。