李 杰， 張聞桐， 黃志強(qiáng)， 劉 濤， 劉 箐

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

沙門菌(Salmonella)屬革蘭氏陰性腸桿菌科，是最早由美國(guó)細(xì)菌學(xué)家Salmon與Smith于1885年發(fā)現(xiàn)[1]的一種常見人畜共患病原菌[2]。目前已發(fā)現(xiàn)有2 500多個(gè)血清型[3]，包括腸道沙門菌和邦戈?duì)柹抽T菌兩個(gè)種，腸道沙門菌又可分為6個(gè)亞種：腸道亞種(S.entericasubsp.enterica)、薩拉姆亞種(S.entericasubsp.salamae)、亞利桑那亞種(S.entericasubsp.arizonae)、雙相亞利桑那沙門菌(S.entericasubsp.diarizonae)、豪頓沙門菌(S.entericasubsp.houtenae)和印度沙門菌(S.entericasubsp.indica)。沙門菌能引起禽傷寒、雞白痢、豬霍亂等動(dòng)物性疾病，以及人類胃腸炎、類傷寒、敗血癥、感冒等感染型食物中毒。據(jù)估計(jì)，每年有超過19萬人死于傷寒、甲型、乙型和丙型副傷寒沙門菌[4]，沙門菌感染是威脅人類健康和全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大疾病[5,6]。

III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion systems，T3SSs)是一個(gè)多組分蛋白復(fù)合體組成的跨膜通道，通過分泌毒力蛋白后直接注入宿主細(xì)胞發(fā)揮致病作用，是僅存在于致病性革蘭氏陰性菌如沙氏菌、銅綠假單胞菌[7]、耶爾森鼠疫桿菌及志賀菌等[8]的蛋白分泌系統(tǒng)，通常被稱為T3SS注射裝置(injectisome)[9]，用于將毒力蛋白(效應(yīng)蛋白)像注射器一樣直接注射到宿主細(xì)胞以達(dá)到侵入并致病的目的[10,11]。在與宿主細(xì)胞接觸后，沙門菌T3SSs被激活并分泌的效應(yīng)蛋白與宿主細(xì)胞相互作用，在沙門菌入侵腸道上皮細(xì)胞的感染過程中起重要作用[12]，也是在吞噬細(xì)胞中存活并引起沙門菌的全身性感染所必需[13]。HU B等[14]通過高通量的低溫電子斷層掃描和亞單位平均技術(shù)，原位確定了沙門菌III型分泌機(jī)制的完整結(jié)構(gòu)，包括細(xì)菌胞外成分、橫跨細(xì)胞膜的基體、胞內(nèi)成分和分子伴侶等四大類，其中主要結(jié)構(gòu)單元基體主要由三種蛋白質(zhì)組成，他們排列成一系列高度低聚的同心環(huán)：包括內(nèi)膜環(huán)(PrgH/PrgK)、輸出裝置、外膜環(huán)(InvG)等結(jié)構(gòu)[15]。當(dāng)T3SS與宿主細(xì)胞接觸后，注射裝置被激活，開始于基座的組裝,隨后是針及內(nèi)桿的組裝,終止于針組裝的完成[16]。T3SS這一復(fù)雜的分子裝置中，某一蛋白的功能被破壞都可能威脅到整個(gè)系統(tǒng)的功能活性, 因此沙門菌T3SS是重要的藥物靶點(diǎn)[17]。

PrgH是具有脂蛋白的結(jié)構(gòu)修飾單元[18]，分泌后被派送到基體內(nèi)膜上，低聚合為24個(gè)拷貝的穩(wěn)定外環(huán)結(jié)構(gòu)[19]，對(duì)T3SS結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和功能活性至關(guān)重要。我們運(yùn)用生物信息學(xué)手段分析PrgH的理化及結(jié)構(gòu)特性,對(duì)不同血清型的沙門菌進(jìn)行特異性基因prgH的PCR鑒定及關(guān)系進(jìn)化樹分析其蛋白保守性,以融合表達(dá)的PrgH蛋白作為免疫原制備了兔多克隆抗體及鼠源單克隆抗體，驗(yàn)證PrgH的免疫原性。本研究對(duì)PrgH蛋白理化及結(jié)構(gòu)特性的分析有助于進(jìn)一步的了解沙門菌T3SS的結(jié)構(gòu)組成及致病機(jī)制；本實(shí)驗(yàn)中制備的針對(duì)T3SS結(jié)構(gòu)蛋白PrgH中和抗體較真實(shí)的反映PrgH較高的免疫原性，為沙門菌藥物靶點(diǎn)的篩選提供參考，同時(shí)制得的多克隆抗體及單克隆抗體抗體或?yàn)門3SS抑制劑的ELISA篩選系統(tǒng)提供材料和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 實(shí)驗(yàn)菌株、細(xì)胞與動(dòng)物：研究涉及的標(biāo)準(zhǔn)致病菌菌株包括27株沙門氏菌(表1)及原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30(a)為本實(shí)驗(yàn)室保存，原核表達(dá)工程菌E.coilDH5α，E.coilBL21購(gòu)買自天根生物技術(shù)有限公司，所有菌株均用LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)；SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞由上海理工大學(xué)有害微生物危害與控制研究所保存；6～8周齡SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠購(gòu)買自中國(guó)上海杰斯捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。2.5 kg雄性6月齡新西蘭白兔由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

(2) 試劑與耗材：一步克隆試劑盒(OneStep Cloning Kit)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG)一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒(One Step BacterialActive Protein Extraction Kit)和 His 標(biāo)簽純化柱(Ni-IDA-Sefinose Column)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖割膠回收試劑盒(BioSpin GelExtraction Kit)和質(zhì)粒抽提試劑盒(BioSpin PlasmidDNA Extraction Kit)購(gòu)自杭州博日科技生物有限責(zé)任公司；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶(horse reddish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自BIOSUN公司。

表1 實(shí)驗(yàn)涉及菌株及編號(hào)

1.2 方法

1.2.1PrgH的生物信息學(xué)分析

從綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed )中檢索prgH的基因序列(Gene ID: 1254397)。PrgH蛋白(P41783)氨基酸序列來自蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot(http://www.uniprot.org/)。PrgH蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息來自結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)RCSB-PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)，并在數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)蛋白的一級(jí)，二級(jí)，三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。運(yùn)行ExPASy 的ProtParam[20](https://web.expasy.org/protparam/)程序分析預(yù)測(cè)PrgH 的理化性質(zhì)。運(yùn)行SignalP 5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序預(yù)測(cè)PrgH是否含有信號(hào)肽及其剪切位點(diǎn)。運(yùn)用跨膜分析軟件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測(cè)PrgH是否為膜上蛋白及其跨膜區(qū)域跨膜。運(yùn)用分子三維結(jié)構(gòu)分析軟件Pymol對(duì)PrgH三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行展示與分析。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成

鼠傷寒沙門氏菌SalmonellaentericaserotypeTyphimurium LT2 (S. Typhimurium LT2)菌株是研究沙門氏菌的模式菌株，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上公布的沙門氏菌LT2菌株上prgH序列(Gene ID：984739)，運(yùn)用Primer3[21](http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)鑒定引物F1-R1，用于目的基因prgH在實(shí)驗(yàn)室保存的沙門菌的廣譜性分析。根據(jù)一步克隆法要求設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的片段的引物F2-R2，構(gòu)建連接目的基因的重組質(zhì)粒，用于目的基因測(cè)序后系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析以及蛋白的原核表達(dá)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司成。

1.2.3序列廣譜性鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

為檢測(cè)目的基因prgH在27株沙門菌的廣譜性，用F1-R1以27株沙門菌為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳(AGE)來分析目的基因prgH的廣譜性。用F2-R2擴(kuò)增27株沙門菌的prgH片段連接至pET30a載體，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后抽取質(zhì)粒，送至上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果運(yùn)用MEGA 7.0[22]構(gòu)建NJ(Neighbor-joining)[23]系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用p-distance[24]法計(jì)算進(jìn)化距離。

1.2.4PrgH原核表達(dá)及純化

根據(jù)進(jìn)化樹結(jié)果，以序列同源性最高的沙門菌SalmonellaTyphimurium ATCC 14028為模板對(duì)目的片段prgH進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后的目的片段用一步克隆試劑盒重組至質(zhì)粒pET30a上，將重組質(zhì)粒pET30a-prgH轉(zhuǎn)化到EcoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，50 mg/mL卡那霉素抗性篩選及PCR鑒定為雙陽(yáng)性的菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒送至上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌EcoliBL21(DE3)，培養(yǎng)BL21-pET30a-prgH至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即OD600 nm為0.6～0.8時(shí)加入誘導(dǎo)表達(dá)劑0.2 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)4 h。采用一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒從EcoliBL21(DE3)中提取可溶性蛋白，之后用8 mol/L尿素處理包涵體，SDS-PAGE鑒定重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

300 mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)BL21-pET30a-prgH，誘導(dǎo)表達(dá)后富集菌體后用10 mL 0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖液重懸，重懸液于冰浴超聲破碎(5 s,10 s,40 min,150 W)，12 000 r/min離心20 min，分離收集上清，沉淀用8 mol/L尿素于37 ℃處理1 h，12 000 r/min離心20 min后留上清即為包涵體蛋白。根據(jù)Ni-NTA親和層析柱試劑盒說明分別對(duì)胞質(zhì)活性表達(dá)蛋白及包涵體表達(dá)蛋白進(jìn)行純化。

1.2.5動(dòng)物免疫

取5只6～8周齡SPF級(jí) Balb/c雌鼠體重18±2 g左右，耳標(biāo)編號(hào)NO.1～NO.5，對(duì)小鼠采用小腿肌肉注射PrgH進(jìn)行免疫。共免疫3次：第一次為PrgH蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合液，注射劑量為100 μg/只；于第三周及第四周加強(qiáng)免疫2次，將PrgH蛋白于弗氏不完全佐劑1∶1混合，注射劑量為100 μg /只。對(duì)6周齡新西蘭白兔頸背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫，免疫劑量為500 μg/只，首次免疫后第三周、第五周、第六周加強(qiáng)免疫三次。

卡夫卡與父親關(guān)系的奇特之處在于，“A給B一個(gè)坦率的、與他的人生觀相符的、不太美的、但卻是今天在城市里很有普遍意義的、也許能防止健康受損的建議。這個(gè)建議對(duì)B在道德上沒有多大鼓舞力量，但他難道就不能隨著歲月的推移逐漸從這種損傷中擺脫出來嗎？再說，他并不是非聽從這個(gè)建議不可的，何況僅僅在這個(gè)建議中也看不出促使B的整個(gè)未來世界將崩潰的因素。但事情偏偏還是這樣發(fā)生了，原因僅僅在于；你是這個(gè)A，我是這個(gè)B”[4]461-501。

1.2.6多克隆抗體制備及其效價(jià)測(cè)定

新西蘭兔免疫前耳緣靜脈采血作為陰性對(duì)照，最后一次加強(qiáng)免疫一周后心臟采血;室溫放置1 h后4 ℃靜置過夜，待血清析出后4 000 r/min離心10 min，分離后的血清經(jīng)飽和硫酸銨沉淀，12 000 r/min離心30 min后獲得的沉淀即為PrgH兔多克隆抗體，最后將抗體置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。酶?lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定多克隆抗體與PrgH蛋白以及不同血清型沙門菌的結(jié)合情況。具體操作為：30 μg/mL PrgH, 100 μL/孔或者108CFU每孔沙門菌加入96孔板中，4 ℃過夜包板； PBST洗板3次后加入200 μL 3%脫脂乳粉封閉液，37 ℃孵育2 h；洗板后加入100 μL 1∶1 000～1∶2 048 000倍比稀釋的PrgH多克隆抗體，37 ℃孵育1 h；洗板后加入100 μL/孔的TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)15 min；加入50 μL/孔2 mol/mL的濃硫酸終止液后測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光值。

1.2.7單克隆抗體制備及其效價(jià)測(cè)定

小鼠三免后一周尾靜脈取血，間接ELISA 測(cè)定NO.1—NO.5五只小鼠血清中特異性抗體水平，抗體效價(jià)最高的小鼠在沖擊免疫后三天用于細(xì)胞融合。具體操作為：摘眼球取血作為陽(yáng)性血清，小鼠脫頸處死后取脾細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中以50% PEG(MW2000)作為促溶劑誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用含HAT/HT選擇性培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，間接ELISA法測(cè)定孔板細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的效價(jià)確定陽(yáng)性孔，采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行單細(xì)胞克隆，篩選出穩(wěn)定產(chǎn)生特異性抗體的單細(xì)胞株即為單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。

將篩選的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度2×106細(xì)胞/mL，選取8周齡Balb/c雌性小鼠5只，腹腔注射液體石蠟0.3 mL/只，7 d～14 d后，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞0.3 mL/只，10 d左右活體抽取腹水，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀初步純化后，用Protein-G柱親和層析進(jìn)行純化，SDS-PAGE檢驗(yàn)抗體純化效果。ELISA測(cè)定單克隆抗體與PrgH以及不同血清型沙門菌的結(jié)合情況并利用抗體亞型試劑盒對(duì)單克隆抗體的亞型進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 PrgH的理化性質(zhì)

NCBI及Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)注釋PrgH的基因全長(zhǎng)1 179 bp，編碼392個(gè)氨基酸。經(jīng)ProtParam軟件分析，PrgH相對(duì)分子量為44 460，等電點(diǎn)理論值5.73，酸性氨基酸總數(shù)(Asp+Glu)為50個(gè)，堿性氨基酸總數(shù)(Arg+Lys)為45個(gè)，不穩(wěn)定指數(shù)為45.55，屬不穩(wěn)定蛋白，在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10 h(原核表達(dá)蛋白時(shí)間)，脂肪族氨基酸指數(shù)為88.57，平均親水系數(shù)為-0.391，為親水性蛋白。

2.2 PrgH的信號(hào)肽分析

SignalP-5.0對(duì)PrgH的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1所示，兩種常規(guī)分泌通路(Sec/SPI)，(Sec/SPII)以及雙精氨酸轉(zhuǎn)移通路(Tat/SPI)的信號(hào)肽的可能性都小于0.1，表明PrgH中不存在信號(hào)肽片段，不是分泌蛋白。

圖1 PrgH信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.4 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

三維結(jié)構(gòu)6duz.pdb是由HU J[25]等利用透射電鏡研究所得晶體衍射結(jié)構(gòu)，由PrgH(172-364)與PrgK聚合而成的48聚體，是T3SS高度低聚化的空環(huán)結(jié)構(gòu)，其中PrgH為外環(huán)，PrgK為外環(huán)。經(jīng)過軟件Pymol處理，去掉PrgK結(jié)構(gòu)后展示的PrgH 24聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)如圖3-A所示，共由24條重復(fù)單鏈 A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K,L,M,N,O,P,Q,R,S,T,U,V,W,X聚合而成，其中圖3-B為單鏈A的三維結(jié)構(gòu)。圖3-C為Pymol展示的三維結(jié)構(gòu)3j1w.pdb是BERGERON JR[26]等利用透射電鏡研究所得晶體衍射結(jié)構(gòu)，由PrgH(14-119)的24條單鏈聚合而成，圖3-D所示三維結(jié)構(gòu)圖為Pymol展示的PrgH(14-119)單鏈A。

A. PSIPRED預(yù)測(cè)的PrgH二級(jí)結(jié)構(gòu)；B. TMHMM對(duì)PrgH跨膜結(jié)構(gòu)分析；C. MEMSAT-SVM預(yù)測(cè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)
圖2 PrgH二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 prgH保守性鑒定及進(jìn)化樹構(gòu)建

(1) 目的基因prgH的鑒定引物為F1-R1，其中上游引物F1序列為：5′-CTGCTTCAGGTCAACTCCCT-3′；下游引物R1：5′-ATAACCTTCCGCCCCGTAC-3′，鑒定目的片段的長(zhǎng)度為995 bp。F1-R1引物用于目的基因prgH在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有沙門菌中的覆蓋率分析，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖4所示，prgH在27株沙門菌(菌株編號(hào)如表1)中的覆蓋率高達(dá)100%，且目的片段大小在995 bp左右。

(2) 根據(jù)一步克隆法要求設(shè)計(jì)用于質(zhì)粒重組的引物F2-R2，其中上游引物F2序列為：5′-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGAAACATCAAAAGAGA-A3′；下游引物R2：5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAAGTGGGCTTGGGAAAT-3′，上下游引物分別引入BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線處)。引物F2-R2用于將26株不同的沙門菌的目的片段prgH重組到質(zhì)粒pET30a，測(cè)序后結(jié)果由MEGA7構(gòu)建NJ進(jìn)化樹進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，該方法給出了樹枝長(zhǎng)度和為0.025 365 78的最優(yōu)進(jìn)化樹，選擇Bootstrap consensus tree[27]，系統(tǒng)發(fā)生樹中絕大多數(shù)節(jié)點(diǎn)處的數(shù)值≥70，反映該進(jìn)化樹的可信度較高。將prgH序列經(jīng)blastn比對(duì)，顯示同源性均高于99%，其中目的基因prgH在SalmonellaTyphimurium ATCC 14028與模式菌株SalmonellaTy-phimurium LT2中同源性為100%，故選做蛋白表達(dá)的模板菌株。

A. PrgH (172-364) 24聚體三維結(jié)構(gòu)；B. PrgH (172-364) 單鏈A三維結(jié)構(gòu)；C. PrgH(14-119)24聚體三維結(jié)構(gòu)；D. PrgH(14-119)單鏈A三維結(jié)構(gòu)，所有結(jié)構(gòu)圖均Pymol軟件處理并展示

圖3 PrgH三維結(jié)構(gòu)圖

圖4 prgH在27株沙門菌中的PCR鑒定

2.6 原核表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒pET30a-prgH表達(dá)蛋白的大小為55 000，SDS-PAGE結(jié)果如圖6中的泳道8所示，pET30a-BL21-prgH的誘導(dǎo)表達(dá)效果明顯，在55 000處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致，因此PrgH在BL21(DE3)菌體內(nèi)以包涵體的形式成功表達(dá)。包涵體表達(dá)蛋白用8 mol/L尿素處理并用His標(biāo)簽純化柱純化，經(jīng)6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L，PBS梯度復(fù)性處理后分裝-20 ℃放置備用。

2.7 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA 法測(cè)定多克隆抗體效價(jià)，OD450 nm值大于陰性對(duì)照(Negative control，NC)2.1倍的最高稀釋度即為最終效價(jià)。由圖7-A可知,以PrgH多次免疫后兔血清抗體水平達(dá)到較高值，效價(jià)可達(dá)到1∶1 024 000+，兔血清抗體能與27株沙門菌較好地結(jié)合(圖7-B)。PrgH具有較高的免疫原性且作為免疫原制備的多克隆抗體能夠廣泛覆蓋實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的27株不同血清型的沙門菌。

2.8 單克隆抗體制備及其特性

NO.1-NO.5五只小鼠三免后一周尾靜脈取血，間接ELISA 測(cè)定小鼠血清中特異性抗體效價(jià)均高達(dá)1∶128 000，結(jié)果如圖8-A所示，取NO.5號(hào)小鼠加強(qiáng)免疫后進(jìn)行細(xì)胞融合，篩得兩株能夠穩(wěn)定產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)親和層析柱純化后所得單克隆抗體命名為4G7，4E2。如圖8-B所示，分別有一條55 000左右的重鏈和26 000左右的輕鏈，且抗體純化效果較好。間接ELISA測(cè)定抗體亞型發(fā)現(xiàn)兩株單克隆抗體均為IgG2b，抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果如圖8-C，8-D所示，4G7，4E2效價(jià)分別為1∶2 048 000+，1∶1 024 000，均具有較強(qiáng)的親和力。

圖5 PrgH關(guān)系進(jìn)化樹

Maker：180KD；1：pET30a-BL21未誘導(dǎo)表達(dá)胞質(zhì)蛋白；2：pET30a-BL21誘導(dǎo)表達(dá)胞質(zhì)蛋白；3：pET30a-BL21-prgH未誘導(dǎo)表達(dá)胞質(zhì)蛋白；4：pET30a-BL21-prgH誘導(dǎo)表達(dá)胞質(zhì)蛋白；5：pET30a-BL21未誘導(dǎo)表達(dá)包涵體蛋白；6：pET30a-BL21誘導(dǎo)表達(dá)包涵體蛋白；7：pET30a-BL21-prgH未誘導(dǎo)表達(dá)包涵體蛋白；8：pET30a-BL21-prgH誘導(dǎo)表達(dá)包涵體蛋白。

圖6 PrgH誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

A. PrgH兔多抗血清與PrgH結(jié)合情況；B. PrgH免疫兔多抗血清與沙門菌結(jié)合情況圖7 PrgH免疫兔多抗血清抗體滴度的ELISA測(cè)定

3 結(jié)論

應(yīng)用生物信息學(xué)工具對(duì)沙門菌T3SS的核心結(jié)構(gòu)蛋白PrgH蛋白的理化性質(zhì)，二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及跨膜區(qū)域進(jìn)行了比較系統(tǒng)的分析，結(jié)果表明PrgH是一種單次跨膜、親水性的不穩(wěn)定蛋白，無分泌信號(hào)肽，在T3SSs中以24條單鏈高度低聚為穩(wěn)定的空環(huán)結(jié)構(gòu)存在。prgH在沙門菌中的PCR鑒定顯示，目的基因在27株不同血清型沙門菌的覆蓋率為100%。26株沙門菌中目的片段測(cè)序后建立了可信度高的關(guān)系進(jìn)化樹，目的基因在的blastn比對(duì)結(jié)果顯示同源性高達(dá)98%，prgH在沙門菌中高度保守。融合表達(dá)并純化后的PrgH蛋白進(jìn)行動(dòng)物免疫，制得的兔多克隆抗體效價(jià)高達(dá)1∶1 024 000+，且能與27株沙門菌較好的結(jié)合。篩得兩株單克隆抗體4E2，4G7，效價(jià)分別為1∶1 024 000，1∶2 048 000+，均能與目的蛋白發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)，證明PrgH具有較高的免疫原性。

現(xiàn)有針對(duì)沙門菌感染的主要治療方案仍然是抗生素[28]，但是隨著抗生素的濫用，細(xì)菌耐藥性成為日益嚴(yán)重的問題[29，30]，更多抑菌藥物及疫苗的開發(fā)至關(guān)重要。T3SS在沙門菌致病方面起到重要的作用，而且結(jié)構(gòu)成分蛋白高度保守，是開發(fā)抗菌藥物有效靶標(biāo)。PrgH作為T3SS的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在T3SS的結(jié)構(gòu)模型完整性以及毒力因子的高效轉(zhuǎn)運(yùn)中起到至關(guān)重要的作用，對(duì)PrgH進(jìn)行結(jié)構(gòu)，功能及免疫原性分析以及制備的單克隆抗體或可為沙門菌藥物靶標(biāo)的篩選提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)有助于針對(duì)沙門菌設(shè)計(jì)合理的預(yù)防及治療策略，研發(fā)新的沙門菌檢測(cè)方法及治療藥物，將對(duì)沙門菌感染的預(yù)防和控制有著重要的意義[31]。

A.五只小鼠3免后效價(jià)測(cè)定；B.抗體4G7,4E2純化效果；C.抗體4G7效價(jià)測(cè)定；D.抗體4E2效價(jià)測(cè)定圖8 單克隆抗體及其效價(jià)