劉 峰， 馬 俊

深圳萬(wàn)和制藥有限公司，廣東 深圳 518107

長(zhǎng)雙歧桿菌是嬰兒、成人、老人腸道菌群中最普遍存在的雙歧桿菌[1，2]。盡管腸道菌群的組成可能隨著宿主飲食結(jié)構(gòu)的變化發(fā)生改變，但一些特定的長(zhǎng)雙歧桿菌卻可以在宿主腸道內(nèi)持續(xù)的存在[3，4]。它具有防治便秘[5]、抑制腸道致病菌[6]、調(diào)節(jié)腸道菌群、降低膽固醇[7]、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[8]、延緩衰老[9]和增強(qiáng)機(jī)體免疫活性[10，11]等生理功能。

盡管雙歧桿菌不同菌株的耐受性有很大差異，雙歧桿菌屬對(duì)低pH值還是表現(xiàn)出高度的敏感性[12]。MASCO L等[13]指出，長(zhǎng)雙歧桿菌在pH值為3的條件下處理1 h即開(kāi)始大量減少； MAINVILLE I等[14]指出，動(dòng)物雙歧桿菌的耐受性要明顯優(yōu)于長(zhǎng)雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌。因此動(dòng)物雙歧桿菌最先在歐洲被用于生產(chǎn)乳制品[13,15]。

雙歧桿菌已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等各個(gè)領(lǐng)域。然而，長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)生存環(huán)境要求苛刻，并且不能耐受人體消化道環(huán)境，難以保障足夠的活菌數(shù)到達(dá)人體腸道定植[15]。

滴丸是固體或液體藥物與適宜的基質(zhì)加熱融化、乳化或混懸于基質(zhì)中，再滴入不相混溶、互不作用的冷凝液中，由于表面張力的作用使液滴收縮冷卻成小丸狀的制劑[16]。多層滴丸是將藥物有效成分放在最內(nèi)層，并包括覆蓋最內(nèi)層的內(nèi)皮層，以及覆蓋該內(nèi)皮層構(gòu)成的三層或三層以上的具有一定硬度的無(wú)縫膠囊制劑。最內(nèi)層包含一種油相載體，可以將活菌菌粉均勻分散；內(nèi)皮層是以固化油為主要成分的內(nèi)皮膜，可以防止水分進(jìn)入內(nèi)層；外層是蛋白質(zhì)類(lèi)的外皮膜，具有物理硬度，滴丸不易變形。

在《中國(guó)藥典》的微生態(tài)活菌制品總論中，只有膠囊劑和粉劑的檢測(cè)方法，尚未列出其它不同制劑形式的微生態(tài)活菌制品的活菌數(shù)檢測(cè)方法，更無(wú)滴丸這類(lèi)產(chǎn)品的檢測(cè)手段。而多層滴丸采用多種不同的材料將長(zhǎng)雙歧桿菌層層包裹，在進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)的時(shí)候，使用常規(guī)的方法(中國(guó)藥典法、國(guó)標(biāo)GB4789.35、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO29981)都無(wú)法將其從復(fù)雜的成分中釋放出來(lái)，也就無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)其活菌數(shù)，為此我們開(kāi)發(fā)了一項(xiàng)檢測(cè)方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。

1 材料和方法

1.1 材料

多層滴丸(自制)，長(zhǎng)雙歧桿菌菌粉R175(商業(yè)購(gòu)買(mǎi))。

1.2 主要儀器和試劑

均質(zhì)機(jī)(IKA T25D S25)， 高壓滅菌鍋(Yamato SN310C)，天平(Sarorius SQP)，天平(Sarorius MSA 224-CE)，天平(Sarorius BSA224S)，超凈工作臺(tái)(蘇靜安泰 SW-CJ-1FD)，厭氧工作站(SHELLAB BACTRON EZ-2), TOSP Agar(Merck Millipore 100043), Mitsuoka’s buffer (根據(jù)配方自行配制)。

1.3 現(xiàn)有方法對(duì)多層滴丸中長(zhǎng)雙歧桿菌R175活菌數(shù)的檢驗(yàn)

采用三種常規(guī)方法，分別是《中國(guó)藥典》中的微生態(tài)活菌制品活菌數(shù)測(cè)定法，《食品安全標(biāo)準(zhǔn)》中的GB4789.35以及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)ISO29981。

1.4 多層滴丸樣品前處理方法的單因素考察

多層滴丸中長(zhǎng)雙歧桿菌包裹在最內(nèi)層，需要前處理使其從滴丸中釋放出來(lái)。我們對(duì)其采用37 ℃水浴后，再恒溫均質(zhì)的處理方式：稱(chēng)取149 mL Mitsuoka’s buffer，水浴使其溫度恒定在37 ℃，然后加入1 g多層滴丸樣品，繼續(xù)水??；水浴后，對(duì)含有多層滴丸的Mitsuoka’s buffer進(jìn)行37 ℃恒溫均質(zhì)處理。前處理共考察三個(gè)單因素，分別是水浴時(shí)間，均質(zhì)速度和均質(zhì)時(shí)間。

1.5 梯度稀釋、涂布培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

取1 mL前處理后的多層滴丸樣品加入9 mL Mitsuoka’s buffer，反復(fù)吹打混勻，繼續(xù)10倍梯度稀釋至合適的稀釋度，取50 μL涂布在TOSP固體培養(yǎng)基(不含莫匹羅星鋰)，每個(gè)稀釋度3個(gè)板，37 ℃，40 h～44 h，厭氧倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，取菌落數(shù)在30～300個(gè)菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并據(jù)稀釋度計(jì)算出每克樣品中含有的活菌數(shù)。

1.6 檢出率

本方法中檢出率是指多層滴丸樣品中檢測(cè)到的長(zhǎng)雙歧桿菌R175活菌數(shù)占加入的長(zhǎng)雙歧桿菌R175活菌數(shù)的百分比。

2 結(jié)果

2.1 現(xiàn)有方法對(duì)多層滴丸中長(zhǎng)雙歧桿菌R175活菌數(shù)的檢驗(yàn)

這三種方法是比較常用的檢測(cè)雙歧桿菌活菌數(shù)的方法。GB4789.35是食品中乳酸菌活菌數(shù)的檢測(cè)方法。多層滴丸屬于固體樣品，GB4789.35中對(duì)固體樣品的前處理方法為樣品10倍稀釋后，8 000 r/min～10 000 r/min均質(zhì)1 min～2 min，或用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min，用上述方法處理后的多層滴丸樣品，分散性差并有抱團(tuán)現(xiàn)象，只有少量雙歧桿菌從多層滴丸中釋放出來(lái)，檢測(cè)到的活菌數(shù)不足添加量的1%。ISO29981是乳品中雙歧桿菌活菌數(shù)的檢測(cè)方法，對(duì)樣品的前處理方法是振蕩；中國(guó)藥典中的微生態(tài)制劑只有膠囊劑和顆粒劑兩種劑型，前處理方法是對(duì)10倍稀釋的樣品充分搖勻。采用這三種處理方法，很難使雙歧桿菌活菌從具有一定硬度和無(wú)縫包裹的多層滴丸中釋放出來(lái)，檢出率極低。

表1 現(xiàn)有三種方法對(duì)多層滴丸中長(zhǎng)雙歧桿菌R175活菌數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1不同水浴時(shí)間對(duì)檢出率的影響

因多層滴丸樣品的壁材和溫度有關(guān)，基于壁材熔點(diǎn)及考慮不影響長(zhǎng)雙歧桿菌存活的溫度條件，本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品處理的水浴溫度固定為37 ℃，水浴后再進(jìn)行均質(zhì)，考察了不同水浴時(shí)間對(duì)檢出率的影響，實(shí)驗(yàn)參數(shù)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同水浴時(shí)間對(duì)多層滴丸樣品檢出率的影響

從表1可以看出，多層滴丸樣品采用現(xiàn)有三種前處理方法，雙歧桿菌被包裹在多層滴丸中，無(wú)法釋放，基本檢測(cè)不到活菌。從表2可以看出，經(jīng)過(guò)水浴和均質(zhì)，才可能檢測(cè)到其包裹的活菌。隨著水浴時(shí)間的增加，檢出率提高，當(dāng)水浴時(shí)間為10 min時(shí)，檢出率最高；當(dāng)繼續(xù)增加水浴時(shí)間時(shí)，檢出率無(wú)明顯變化，因此選定水浴時(shí)間10 min作為中間水平。

2.2.2不同均質(zhì)速度對(duì)檢出率的影響

水浴時(shí)間設(shè)定為10 min，均質(zhì)時(shí)間設(shè)定為5 min，然后采用4個(gè)不同均質(zhì)速度進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)參數(shù)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同均質(zhì)速度對(duì)多層滴丸樣品檢出率的影響

從表3可以看出，當(dāng)均質(zhì)速度為8 000 r/min～14 000 r/min時(shí)，隨著均質(zhì)速度的提高，檢出率升高。均質(zhì)速度為12 000 r/min時(shí)，檢出率最高，因此選定均質(zhì)速度12 000 r/min作為中間水平。

2.2.3不同均質(zhì)時(shí)間對(duì)檢出率的影響

水浴時(shí)間設(shè)定為10 min，均質(zhì)速度均為12 000 r/min，然后采用4個(gè)不同均質(zhì)時(shí)間進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)參數(shù)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同均質(zhì)時(shí)間對(duì)多層滴丸樣品檢出率的影響

從表4可以看出,在均質(zhì)時(shí)間1 min～5 min范圍內(nèi)，隨著均質(zhì)時(shí)間的增加，檢出率升高，繼續(xù)增加均質(zhì)時(shí)間，檢出率沒(méi)有明顯變化，甚至稍有下降，可能由于均質(zhì)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度升高，導(dǎo)致部分活菌死亡。因此選定均質(zhì)時(shí)間5 min作為中間水平。

2.3 基于中心復(fù)合設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法優(yōu)化前處理參數(shù)

2.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期多層滴丸樣品前處理單因素考察結(jié)果，我們采用基于中心復(fù)合設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法對(duì)前處理參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。以Box-Behnken為模型，以均質(zhì)速度(A)，均質(zhì)時(shí)間(B)，水浴時(shí)間(C)為考察因素，以檢出率作為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

表5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表

表6 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

以Box-Behnken為模型設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)SAS9.2軟件采用正交旋轉(zhuǎn)二次回歸對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，建立了二次響應(yīng)面回歸模型，并進(jìn)而求得了最優(yōu)響應(yīng)因子水平。所得的分析結(jié)果如表7。

從表5～表7可得出二次回歸方程為：

檢出率(%)=70.46+0.24A+0.80B+2.81C-1.28AB+1.25AC+0.43BC-1.06A2-2.28B2-4.56C2

對(duì)上述方程中A、B、C求偏導(dǎo)，得出如下三個(gè)方程：

0.24-1.28B+1.25C-2.12A=0

0.8-1.28A+0.43C-4.56B=0

表7 方差分析

2.81+1.25A+0.43B-9.12C=0

解出即得，A=0.231，B=0.143 3，C=0.346 5。對(duì)應(yīng)的各因素水平為均質(zhì)速度為12 462 r/min，均質(zhì)時(shí)間為5 min 17 s，水浴時(shí)間為11 min 44 s。

根據(jù)上述回歸方程作出響應(yīng)面分析圖，響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1

2.3.3實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為驗(yàn)證優(yōu)化模型，根據(jù)模型優(yōu)化的試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)，理論檢出率為71.03%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件對(duì)三層滴丸進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的雙歧桿菌檢出率分別為71.88%，72.22%，71.12%，平均為71.74%，與理論值接近。因此，基于響應(yīng)面優(yōu)化多層滴丸中長(zhǎng)雙歧桿菌R175活菌數(shù)檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠。

3 討論

3.1 本方法的建立使多層滴丸中雙歧桿菌的活菌數(shù)得到了有效檢測(cè)

多層滴丸國(guó)內(nèi)外研究較少，尤其是多層滴丸在益生菌方面的應(yīng)用，鮮有報(bào)導(dǎo)，更沒(méi)有針對(duì)滴丸型活菌產(chǎn)品的檢測(cè)方法。益生菌多層滴丸需要通過(guò)多種不同性質(zhì)的壁材來(lái)滿(mǎn)足益生菌活著到達(dá)腸道的目的，成分復(fù)雜并含有大量固化油成分。同時(shí)，其外層為保證丸體的完整性，硬度較大，目前常見(jiàn)的前處理方法如ISO29981的振蕩，GB4789.35中的8 000 r/min～10 000 r/min均質(zhì)1 min～2 min，不足以將外層破碎，使中層和內(nèi)層從滴丸中分散出來(lái)。而且，常見(jiàn)方法中沒(méi)有對(duì)樣品進(jìn)行恒溫處理，容易造成多層滴丸樣品抱團(tuán)，使內(nèi)層活菌仍然被包裹或僅一小部分釋放到緩沖液中，檢測(cè)結(jié)果和實(shí)際偏差較大。為此，對(duì)多層滴丸前處理的方法進(jìn)行了優(yōu)化。

圖2

圖3

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，基于中心復(fù)合設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析方法對(duì)于多層滴丸中長(zhǎng)雙歧桿菌R175活菌數(shù)檢測(cè)方法的優(yōu)化，是一個(gè)合適的優(yōu)化工具。影響多層滴丸樣品前處理結(jié)果的因素包括均質(zhì)速度，均質(zhì)時(shí)間和水溶時(shí)間。響應(yīng)面分析法從這些因素中找到了最優(yōu)的樣品前處理參數(shù)。通過(guò)本次研究，我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)多層滴丸使用Mitsuoka’s buffer緩沖液，37 ℃水浴11 min 44 s，12 462 r/min均質(zhì)5 min 17 s，并采用TOSP培養(yǎng)基，可獲得較好的活菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果。我們優(yōu)化后活菌數(shù)檢出率和優(yōu)化前相比較，比原來(lái)GB4789.35的方法提高2個(gè)數(shù)量級(jí)，比ISO29981的方法提高6個(gè)數(shù)量級(jí)。綜上，利用響應(yīng)面法成功地優(yōu)化了多層滴丸中長(zhǎng)雙歧桿菌R175活菌數(shù)檢測(cè)方法，可以用于多層滴丸中長(zhǎng)雙歧桿菌R175的活菌檢測(cè)。

3.2 顯著性分析

由表7可知，回歸系數(shù)為0.971 9，大于0.9，表明該模型相關(guān)性好。P值為0.000 1，說(shuō)明該模型達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，該實(shí)驗(yàn)方法可靠。方程失擬項(xiàng)為0.706 9，大于0.05，所以不顯著，說(shuō)明該回歸模型擬合度較好。其中，均質(zhì)時(shí)間(B)的一次項(xiàng)，均質(zhì)速度(A)和均質(zhì)時(shí)間(B)的交互項(xiàng)，均質(zhì)速度(A)和水浴時(shí)間(C)的交互項(xiàng)，均質(zhì)時(shí)間(B)的二次項(xiàng)均達(dá)到顯著水平(P<0.05)； 水浴時(shí)間(C)一次項(xiàng)和水浴時(shí)間(C)二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。選取的因素對(duì)檢出率的影響大小依次為：水浴時(shí)間(C)>均質(zhì)時(shí)間(B)>均質(zhì)速度(A)。

通過(guò)表6看出，三個(gè)因素0水平(37 ℃水浴10 min，12 000 r/min均質(zhì)5 min)檢出率平均值為70.46%，而最優(yōu)條件(37 ℃水浴11 min 44 s，12 462 r/min均質(zhì)5 min 17 s)檢出率平均值為71.74%，兩者檢出率差異為1.44%。在統(tǒng)計(jì)分析上，兩者沒(méi)有顯著性差異，這可能和這個(gè)產(chǎn)品的特性有關(guān)。在這些因素水平下，檢出率可能已經(jīng)接近極限。通過(guò)響應(yīng)面分析方法，我們發(fā)現(xiàn)，和其他水平相比，0水平是較優(yōu)的條件，同時(shí)最優(yōu)條件的檢出率平均值要好于0水平的檢出率平均值。因此，我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和考察結(jié)果具有實(shí)用價(jià)值。

在實(shí)際操作中，樣品前處理參數(shù)中的轉(zhuǎn)速12 462 r/min較難控制。為了方便操作，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用可控制的前處理參數(shù)：37 ℃水浴11 min 44 s，12 400 r/min均質(zhì)5 min 17 s。

3.3 建立本檢測(cè)方法，可以指導(dǎo)益生菌多層滴丸的研發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

研究表明，益生菌在產(chǎn)品制劑中的活菌數(shù)至少要達(dá)到107CFU·mL-1或g-1才能對(duì)宿主發(fā)生益生功能[12]。所以活菌數(shù)是評(píng)價(jià)微生態(tài)制劑益生功效的核心指標(biāo)。

雙歧桿菌是應(yīng)用較多的一類(lèi)益生菌，雙歧桿菌專(zhuān)性厭氧，對(duì)氧氣、pH、溫度、濕度等外界不良環(huán)境因素極為敏感[17]，長(zhǎng)雙歧桿菌作為雙歧桿菌屬的一個(gè)種，對(duì)環(huán)境也極為敏感，在生產(chǎn)、貯藏和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中活菌數(shù)下降迅速[15]。同時(shí)雙歧桿菌多不能抵抗動(dòng)物消化道的胃酸、膽鹽及多種消化酶的作用，我們使用多層滴丸的制劑技術(shù)幫助雙歧桿菌抵抗胃腸道的苛刻環(huán)境，來(lái)增強(qiáng)其對(duì)消化系統(tǒng)的耐受性。

但目前，多層滴丸在益生菌方面的研究較少，針對(duì)多層滴丸中的雙歧桿菌活菌數(shù)的評(píng)價(jià)，沒(méi)有合適的方法，得不到有效的數(shù)據(jù)。為此，需要建立一個(gè)針對(duì)性的方法，用以評(píng)價(jià)多層滴丸的核心質(zhì)量指標(biāo)即雙歧桿菌的活菌數(shù)。有了這種檢測(cè)方法，對(duì)益生菌多層滴丸的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有指導(dǎo)意義，可以通過(guò)對(duì)活菌數(shù)的變化情況來(lái)評(píng)估工藝的可行性，設(shè)定合理的參數(shù)；通過(guò)長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究過(guò)程中活菌數(shù)的變化規(guī)律，制定產(chǎn)品的貯藏條件和具體的保質(zhì)期。同時(shí)也為多層滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。