黃擎宇, 徐 錚*, 熊 強(qiáng), 張 倩, 李克文, 徐 虹
1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 211816;2.保齡寶生物股份有限公司,山東 禹城 251200
目前,世界范圍內(nèi)的肥胖、糖尿病、高血壓和高脂血癥等體重過度增加相關(guān)疾病的患病率和發(fā)病率顯著增加,而高脂肪高熱量食品是導(dǎo)致這種情況的主要原因。在中國(guó)這一現(xiàn)象尤為嚴(yán)重,肥胖患者與糖尿病患者數(shù)量已接近2億,并呈現(xiàn)出低齡化趨勢(shì)。在這一環(huán)境下,人們?cè)絹碓街匾暿称返陌踩院蛯?duì)人體健康的影響。低熱量、具備多種功能的食品因此在市場(chǎng)上越來越受到消費(fèi)者歡迎,對(duì)此類食品的研究與開發(fā)成為了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注重點(diǎn)。D-阿洛酮糖是一種自然界存在極少的稀有糖,由于其對(duì)健康的益處,許多團(tuán)隊(duì)陸續(xù)開始對(duì)其在功能性食品領(lǐng)域的研究與開發(fā)進(jìn)行研究。
D-阿洛酮糖(D-psicose/D-Allulose)是一種稀有糖,甜度為蔗糖的70%[1],作為碳水化合物的不可發(fā)酵組分以及作為農(nóng)產(chǎn)品中的游離糖存在。D-阿洛酮糖為白色粉末狀晶體,溶于水、甲醇、乙醇等,是D-果糖的C-3差向異構(gòu)體(見圖1),IUPAC名為(3R,4R,5R)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one。D-阿洛酮糖化學(xué)式為C6H12O6,摩爾質(zhì)量為180.156 g/mol,熔點(diǎn)為109 ℃,PSA118.22,CAS號(hào)551-68-8。安全性方面,D-阿洛酮糖已在2014年通過了美國(guó)FDA安全認(rèn)證,2015年獲得了GRAS的認(rèn)證[2]。
圖1 D-阿洛酮糖和D-果糖的化學(xué)式
自然界中天然存在的D-阿洛酮糖含量極少,來源于少部分植物和少數(shù)細(xì)菌。2006年,香川大學(xué)IZUMORI團(tuán)隊(duì)測(cè)定了日常生活中不同食品的D-阿洛酮糖的含量并公布了部分?jǐn)?shù)據(jù)[3](見表1)。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),各種食品中的D-阿洛酮糖含量與制糖過程中的糖濃度,溫度和加熱時(shí)間密切相關(guān)。
表1 不同食品中的D-阿洛酮糖含量[3](μg/g)
日本科學(xué)家TAKATA等[4]通過建立并研究神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamin,6-OHDA)誘導(dǎo)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的體外帕金森氏病模型,發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖對(duì)于細(xì)胞凋亡的抑制展示出了特殊效果,說明其可以起到保護(hù)神經(jīng)的作用。在治療神經(jīng)變性疾病時(shí),由于D-阿洛酮糖可促進(jìn)內(nèi)谷胱甘肽的增量調(diào)節(jié),因而有望作為保護(hù)劑進(jìn)行研發(fā)。
相對(duì)其他稀有糖,D-阿洛酮糖能更加有效地清除活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和抑制其產(chǎn)生的能力[5],對(duì)先天免疫系統(tǒng)具有保護(hù)作用,這種功能對(duì)于防治多種疾病具有潛在的價(jià)值。例如D-阿洛酮糖能夠抑制ROS在睪丸組織中產(chǎn)生,從而阻止由di-(2-eth-ylhexyl)phthalate(DEHP)誘導(dǎo)的睪丸損傷,同時(shí)對(duì)氧化劑介導(dǎo)的睪丸損傷起到保護(hù)作用。由于對(duì)前炎性細(xì)胞活素有抑制作用,D-阿洛酮糖可以使炎性反應(yīng)中斷起到抗炎效果[6];通過調(diào)節(jié)p38-促分裂原活化蛋白激酶(p38-Mitogen-Activated Protein Kinase),單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)可被D-阿洛酮糖抑制,這在動(dòng)脈粥樣硬化治療時(shí)可以發(fā)揮作用[7]。
D-阿洛酮糖的甜度在相當(dāng)于蔗糖甜度的70%的同時(shí)幾乎不含熱量,在美國(guó)被稱為最具潛力的蔗糖替代品。IZUMORI團(tuán)隊(duì)[8]2006年的小鼠實(shí)驗(yàn)表明了相較于攝入其他糖類的小鼠組,攝入D-阿洛酮糖的小鼠血糖水平均比較低,后經(jīng)分析得知D-阿洛酮糖可以通過對(duì)脂肪肝酶和腸道α-糖苷酶的抑制,從而降低小腸對(duì)糖類的吸收速率來減少體內(nèi)脂肪的積累并抑制血糖濃的上升,可以用于對(duì)糖尿?、蛐偷闹委焄9]。在日本自治醫(yī)科大學(xué)的研究人員發(fā)布的一項(xiàng)小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中[10],他們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖可以促進(jìn)“GLP1”的分泌,而GLP1可促進(jìn)胰島素分泌、抑制食欲,能有效治療糖尿病。此外,HAYASHI和IIDA等人[11]通過臨床試驗(yàn)結(jié)果證明了日常飲食中添加D-阿洛酮糖能降低餐后血糖水平,以及提高胰島素的敏感性和葡萄糖耐受性,大部分D-阿洛酮糖在小腸中被吸收并通過尿液從體內(nèi)排泄出去。
除了醫(yī)療價(jià)值,D-阿洛酮糖的口感和甜度與蔗糖相近,作為一種功能性甜味劑還能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)的甜味劑的不足,可以改善食品的風(fēng)味、色澤、外觀和口感,具有延長(zhǎng)貨架期等作用[12]。添加了D-阿洛酮糖的食品的膠凝度不僅可以得到提高,其風(fēng)味也能夠被改善。同時(shí)D-阿洛酮糖還可以和食品蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)[13]可以形成較好的交聯(lián)結(jié)構(gòu),改善食品質(zhì)構(gòu),并使食品在抗氧化性方面也有所提升[14]。在食品的加工中,利用D-阿洛酮糖與蛋白的美拉德反應(yīng)制成的功能性食品和特醫(yī)食品可對(duì)某些特定疾病進(jìn)行防治,例如預(yù)防由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的疾病、抗齲齒等[15]。
D-阿洛酮糖對(duì)植物也有一定影響。香川大學(xué)農(nóng)學(xué)研究所的研究人員稱發(fā)現(xiàn)了幾種稀有糖誘導(dǎo)水稻等害蟲防御相關(guān)基因的表達(dá),同時(shí)他們正在研究稀有糖對(duì)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的作用,以及用于抗病誘導(dǎo)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的材料的開發(fā)[16],而D-阿洛酮糖就包含在這些稀有糖中。
阿洛酮糖的研究到今天約有28年的歷史[17]。迄今為止,D-阿洛酮糖的制取有生物合成法和化學(xué)合成法兩種。首先討論的是化學(xué)合成法,在2017年授權(quán)的一項(xiàng)專利(授權(quán)公告號(hào):CN104447888B)[18]中,研究人員主要采用化學(xué)方法,選取價(jià)格較為低廉的葡萄糖作為原料,選擇無機(jī)材功能料鉬酸鹽作為催化劑,在80 ℃~120 ℃加熱后經(jīng)催化轉(zhuǎn)化、分離提純得到產(chǎn)物D-阿洛酮糖。產(chǎn)物通過有機(jī)溶劑法進(jìn)行降溫結(jié)晶得到的D-阿洛酮糖產(chǎn)品,其含量可達(dá)98.5%~99.5%。相較于生物酶法生產(chǎn)D-阿洛酮糖出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化效率低,反應(yīng)慢、耗時(shí)長(zhǎng)的問題,化學(xué)合成法的優(yōu)勢(shì)十分明顯。但化學(xué)合成存在著純化步驟較復(fù)雜,會(huì)產(chǎn)生化學(xué)廢料和無價(jià)值副產(chǎn)物等問題[19],同時(shí)化學(xué)合成甜味劑甜味往往不夠純正,此法的產(chǎn)物與天然存在的D-阿洛酮糖口感是否存在差距還有待考證。并且化學(xué)合成法的應(yīng)用并不廣泛[20],D-阿洛酮糖實(shí)際上難以化學(xué)合成[21]。
2.2.1菌種和酶
酶作為催化劑在精細(xì)化學(xué)品制造和食品加工等不同領(lǐng)域占有重要地位[22],當(dāng)今世界上生產(chǎn)D-阿洛酮糖的主要方法是以酶作為催化劑的生物合成法。在國(guó)外,日本香川大學(xué)的IZUMORI, YAMAKITA等人[17]1990年從菊芋假單細(xì)胞菌(Pseudomonascichorii)中分離純化得到D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose 3-epimerase,DTEase),首次描述了以D-塔格糖等為底物用生物方法合成D-阿洛酮糖的過程,并根據(jù)用于表征細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)中的菌株的結(jié)果將該生物體表征為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenessp.701 B)。這次的探索象征著D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的開始,該轉(zhuǎn)化法也屬于后來提出的Izumoring法[23]。目前,已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并表征的可用于D-阿洛酮糖生物法合成的生物催化劑有D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase,DPEase) 和D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶,并且大多數(shù)情況選擇D-果糖通過這兩種酶催化轉(zhuǎn)化來制取D-阿洛酮糖。已發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生DTE酶的菌種有菊芋假單細(xì)胞菌和類紅球細(xì)菌[24](Rhodobactersphaeroides)等;DPE酶的來源較多,包括根癌土壤桿菌[25](Agrobacteriumtumefaciens)、解纖維梭菌[26](Clostridiumcellulolyticum)、瘤胃菌[27](Ruminococcussp.)、梭狀芽孢桿菌[28](Clostridiumbolteae)、梭菌屬[29](Clostridiumsp.)和螺旋梭菌[30](Clostridiumbolteae)等。
在使用過程中,酶的保存是極為重要的一環(huán),能夠延長(zhǎng)酶的儲(chǔ)存壽命并保持穩(wěn)定性是將其投入商業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)。江南大學(xué)的研究人員通過對(duì)比不含添加劑的DPE酶與加入一些常用的提高酶穩(wěn)定性的化學(xué)添加劑的DPE酶在15 d和30 d后的活性,得出結(jié)論MnSO4和乙二醇對(duì)于提高DPE酶的穩(wěn)定性和儲(chǔ)存有很大的幫助[31]。TSENG等人[32]發(fā)表了關(guān)于來源有Agrobacteriumsp. ATCC 31749的DPE酶研究成果的論文,文中提到他們發(fā)現(xiàn)ATCC 31749產(chǎn)出的DPE酶活性高于來源于根瘤土壤桿菌的DPE酶,除此之外還鑒定出殘留N234作為重要的界面殘基,對(duì)酶活性的影響極為顯著。隨著專家學(xué)者們?cè)絹碓疥P(guān)注,有關(guān)DPE酶與DTE酶在保存、提高酶活等方面的研究也會(huì)成為D-阿洛酮糖研究中的熱點(diǎn)。
2.2.2國(guó)內(nèi)外發(fā)展動(dòng)向
韓國(guó)CJ第一制糖株式會(huì)社和日本松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社是當(dāng)今世界上生產(chǎn)D-阿洛酮糖主要的廠家[21]。松谷化學(xué)工業(yè)[33]主要是利用從不具有植物病原性的節(jié)桿菌(Arthrobactersp.ConnandDimmick)中得到的新型酮糖3-差向異構(gòu)酶催化D-阿洛酮糖和D-果糖之間的互相轉(zhuǎn)化,這與先前相比更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。2011年授權(quán)的一項(xiàng)專利中,韓國(guó)CJ第一制糖株式會(huì)社[34]的研究人員克隆了源自根瘤土壤桿菌的DTE酶并表達(dá),首次證明了只有源自根瘤土壤桿菌ATCC33970的DTE酶具有具有將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的能力(圖2)。
圖2 簡(jiǎn)易工藝流程圖
D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化是可逆反應(yīng),如果能夠使反應(yīng)平衡朝著生成-阿洛酮糖的方向移動(dòng),即可大幅度提高轉(zhuǎn)化率。2008年,韓國(guó)世宗大學(xué)Oh團(tuán)隊(duì)[35]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著硼酸鹽的加入,平衡逐漸向D-阿洛酮糖方向移動(dòng),當(dāng)硼酸鹽與D-果糖的摩爾比達(dá)到0.6時(shí)達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率,約為無硼酸鹽加入時(shí)的兩倍。研究人員解釋為由于硼酸鹽對(duì)不同糖親和力不同,其對(duì)D-阿洛酮糖的親和力要高于對(duì)D-果糖,因而與D-阿洛酮糖結(jié)合形成D-阿洛酮糖-硼酸鹽復(fù)合物,且形成的復(fù)合物不參與反應(yīng)。
重組后的大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)效率明顯提高,非常適合用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn)。但大腸桿菌是一種潛在病原菌[36],不是公認(rèn)的安全菌株,且產(chǎn)物多為包涵體,在食品及醫(yī)藥等行業(yè)的使用受到限制。2016年,Oh團(tuán)隊(duì)在將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖時(shí)嘗試了用GRAS菌株谷氨酸棒狀桿菌作為宿主表達(dá)DPEase基因,研究不同pH,溫度,金屬離子和細(xì)胞及底物濃度等條件對(duì)反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)金屬離子Co2+對(duì)提升酶的活力的作用最為明顯。此外,谷氨酸棒狀桿菌經(jīng)過透化后在優(yōu)化條件下進(jìn)行反應(yīng),通過Bio-LC系統(tǒng)(Dionex ICS-3000,USA)用電化學(xué)檢測(cè)器和CarboPac PA10色譜柱測(cè)定單糖濃度。分析得到,10 g/L透性細(xì)胞可使750 g/LD-果糖產(chǎn)生235 g/LD-阿洛酮糖,轉(zhuǎn)化率達(dá)到31%(w/w),是非透性細(xì)胞的1.4倍[37]。
在國(guó)內(nèi),江南大學(xué)江波團(tuán)隊(duì)[23]在2008年對(duì)魚塘淤泥、水樣中富集分離的細(xì)菌進(jìn)行分析篩選,得到一株轉(zhuǎn)化率較高的類紅球細(xì)菌(RhodobacterphaeroidesSKO11),其產(chǎn)率達(dá)到6.54%。2011年該團(tuán)隊(duì)以微生物ClostridiumcellulolyticumH10的基因?yàn)槟0?,通過基因合成成功獲得了DTE的編碼基因,并采用1 mmol/L的IPTG在28 ℃下誘導(dǎo)6 h后在大腸桿菌中成功表達(dá)[26]。天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究人員柏瑋等人[38]將來源于ClostridiumcellulolyticumH10的DPE基因與根癌土壤桿菌的DPE基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩者相似度為60%,同樣可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的互相轉(zhuǎn)化。該方法中,經(jīng)過在37 ℃下培養(yǎng)16 h后得到的ClostridiumcellulolyticumH10的基因在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中進(jìn)行表達(dá),采用粗提取、親和層析、離子交換色譜三步方法得到純化的重組DPE蛋白,用其在50 ℃催化D-果糖1 h后反應(yīng)達(dá)到平衡,D-果糖轉(zhuǎn)化率為27.34%。
D-葡糖糖被廣泛應(yīng)用于制取D-果糖,為了獲得更廣泛的原料來源和降低成本,日本的研究人員在1995年就進(jìn)行了以D-葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖的實(shí)驗(yàn),但是轉(zhuǎn)化率只有10%[39]。2016年,我國(guó)江波團(tuán)隊(duì)以D-葡糖糖為原料對(duì)D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了更徹底的研究[40]。研究人員在Izumoring法的基礎(chǔ)上,把D-果糖與D-葡萄糖偶聯(lián)作為中間體,嘗試從D-葡萄糖中獲得D-阿洛酮糖。 其原理為先將D-葡萄糖通過D-葡糖糖異構(gòu)酶(GIase, EC 5.3.1.5)轉(zhuǎn)化為D-果糖,同時(shí)立刻用DPEase將轉(zhuǎn)化出的D-果糖異構(gòu)化為D-阿洛酮糖。研究發(fā)現(xiàn)在pETDuet-Glase/DPEase共表達(dá)系統(tǒng)中溫度是影響反應(yīng)的最主要因素,當(dāng)處于65 ℃~75 ℃時(shí)系統(tǒng)高度活躍,相對(duì)活性保持在88%以上。當(dāng)反應(yīng)在最佳條件下達(dá)到平衡時(shí),D-阿洛酮糖、D-果糖和D-葡萄糖的平衡比約為3∶7∶6.5[40]。研究人員還指出加入硼酸鹽作為一種有效手段,有望幫助該體系轉(zhuǎn)化率獲得進(jìn)一步提高。市場(chǎng)上D-葡萄糖比D-果糖更為常見且價(jià)格更為低廉,D-葡萄糖作為原料可以大大減少生產(chǎn)成本,這一方法為以D-葡萄糖為原料轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)踐依據(jù)。
以D-果糖為原料的生物法生產(chǎn)D-阿洛酮糖的產(chǎn)物為D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物,并且D-果糖占產(chǎn)物的大部分,因此如何從混合物中分離純化出D-阿洛酮糖具有重要意義。
2000年,香川大學(xué)IZUMORI團(tuán)隊(duì)在制取D-阿洛酮糖時(shí)為了從混合物中分離出D-阿洛酮糖,選擇了在發(fā)酵D-果糖時(shí)使用面包酵母而不使用柱層析。研究人員將反應(yīng)產(chǎn)物在有氧條件下在40 L的罐子中用面包酵母處理24 h后,HPLC圖像顯示D-果糖已被全部降解,再在35 ℃下真空蒸發(fā)使上清液濃縮為糖漿后使用乙醇沉淀純化結(jié)晶,60 d內(nèi)可獲得約20 kg的D-阿洛酮糖晶體。這種方法的優(yōu)點(diǎn)十分明顯,簡(jiǎn)單的操作和低廉的成本并可節(jié)省大量勞動(dòng)力,使得其具有應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)并處理D-阿洛酮糖的潛力[41]。
雖然使用面包酵母的分離方法具有一定優(yōu)勢(shì),但實(shí)際情況中例如長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)菌污染等問題的影響使其的應(yīng)用仍未普及。目前,模擬移動(dòng)床(SMB)工藝是世界上工業(yè)生產(chǎn)中分離時(shí)常用的手段,其固定相和流動(dòng)相的有效使用以及操作的連續(xù)性有助于減少溶劑的消耗和促進(jìn)生產(chǎn)率的提高。韓國(guó)仁荷大學(xué)的研究人員使用裝有Dowex 50WX4-Ca2+離子交換樹脂的四柱模擬移動(dòng)床,基于三角理論設(shè)計(jì)并模擬了分離D-阿洛酮糖和D-果糖的SMB過程,最終在穩(wěn)態(tài)下分離出的D-阿洛酮糖純度達(dá)到99.36%[42]。該結(jié)果證明了SMB方法(圖3)的實(shí)用性,并為工業(yè)大規(guī)模處理含有D-阿洛酮糖混合物的進(jìn)一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
圖3 SMB流程簡(jiǎn)圖[42]
離子交換樹脂分離作為制糖工業(yè)中常用的分離方法,江南大學(xué)的研究人員在2011年采用該方法對(duì)不同條件下D-阿洛酮糖的分離效果進(jìn)行了測(cè)定,實(shí)驗(yàn)得出進(jìn)樣量10 mL,柱溫60 ℃,填料體積400 mL,去離子水為流動(dòng)相,流速1 mL/min時(shí)為最佳分離條件,在此條件下可獲得純度為98.3%的D-阿洛酮糖[43]。
2014年,世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布了《成人和兒童糖攝入量指南》,該指南建議人們對(duì)“游離糖”攝入最好不超過總能量攝入的5%[44],而這里所指的“游離糖”即傳統(tǒng)甜味劑如蔗糖、果糖等。2015年,我國(guó)甜味劑年產(chǎn)量由2010年的9.3萬噸達(dá)到了15.4萬噸,每年都在穩(wěn)定增長(zhǎng)。與此同時(shí),新型甜味劑在2016年也已經(jīng)占據(jù)了市場(chǎng)規(guī)模的約82%。因此,具有特殊功能,有益健康的D-阿洛酮糖有著極為廣闊的前景。
D-阿洛酮糖對(duì)于食品的風(fēng)味、色澤、外觀、口感進(jìn)行改善的作用,可以用于冰激凌,巧克力等一些誘人但易發(fā)胖的食物中,一方面保證口感的同時(shí)降低熱量減少發(fā)胖的擔(dān)憂,另一方面可增加食品的銷量;也可以代替薯片,口香糖等日常零食中的阿斯巴甜,做到更加安全衛(wèi)生,并減少食品的加工和貯藏中的氧化損失[45]。除了日常食品中可加入D-阿洛酮糖外,將其做成特醫(yī)食品也是很好的選擇,針對(duì)糖尿病人、肥胖癥患者等人群,做成的食品可以幫助抑制血糖升高和減少脂肪在身體內(nèi)的積累。D-阿洛酮糖對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用使其可以作為保護(hù)劑制成神經(jīng)保護(hù)類藥物、保健品等;同時(shí)在清除ROS、抗齲齒和應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的疾病中的突出表現(xiàn)令其也具有被開發(fā)成藥物的潛力。此外,D-阿洛酮糖對(duì)于植物的特殊作用,例如防蟲害等,如果在日后能夠研究徹底并制造出對(duì)人類和環(huán)境都有利的農(nóng)業(yè)材料也將具有重大意義?!懊褚允碁樘?食以安為先”,在食品安全日漸突出的今天,低熱量、具備多種功能的食品會(huì)逐漸成為人們的主要食品。D-阿洛酮糖作為一種出色的功能性甜味劑,必定可以在未來的食品等行業(yè)發(fā)揮巨大作用,為改善人民生活水平做出貢獻(xiàn)。