(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266003)

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種致命的神經(jīng)退行性疾病。其特征是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的快速進(jìn)行性退化和隨后的四肢肌肉萎縮，約5%～10%的ALS為家族性[1]。目前FDA批準(zhǔn)治療ALS的藥物主要有利魯唑(谷氨酸抑制劑)與依達(dá)拉奉，但其作用機(jī)制尚不完全清楚且療效有限[2]。TDP43是主要定位于細(xì)胞核內(nèi)的一種DNA及RNA結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接[3-4]。但在ALS中異常的TDP43蛋白游離于細(xì)胞核外，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的異常TDP43蛋白聚集，增加了細(xì)胞毒性[5-6]。已有證據(jù)表明清除異常TDP43蛋白已成為治療ALS的一種有效方法[7-8]。替普瑞酮(GGA)是一種無毒的熱休克誘導(dǎo)劑，有證據(jù)表明GGA可以有效通過血腦屏障從而對大腦和脊髓神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用[9-10]。最近的研究表明，APP23轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠通過灌胃GGA，不僅改善了認(rèn)知功能，而且降低了腦組織中Aβ蛋白表達(dá)水平，并且抑制了Aβ斑塊沉積[11]。可見GGA對神經(jīng)退行性疾病具有一定的治療潛力。百草枯(PQ)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷常用于模擬ALS疾病的發(fā)展過程[12-13]。因此，本研究利用PQ誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞作為氧化應(yīng)激模型，研究GGA對異常TDP43蛋白聚集的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞系由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。GGA為美國MCE公司產(chǎn)品。PQ為美國Sigma公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清為美國BI公司產(chǎn)品。所有抗體均為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。MTT試劑盒和Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒為索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞模型的制備及細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色檢測細(xì)胞內(nèi)TDP43

SH-SY5Y細(xì)胞株培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以1 mmol/L PQ處理培養(yǎng)24 h的SH-SY5Y細(xì)胞制備氧化應(yīng)激模型(模型組)，以沒有經(jīng)任何處理的細(xì)胞為對照組，并通過細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色技術(shù)分別檢測模型組和對照組細(xì)胞內(nèi)TDP43的表達(dá)情況。染色步驟按照說明書操作。

1.3 MTT比色法檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率

將研究分為無任何處理SH-SY5Y細(xì)胞組(A組)、以100 μmol/L的GGA處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h組(B組)及以0、20、50、100 μmol/L的GGA處理氧化應(yīng)激模型細(xì)胞24 h組(C～F組)。將各組舊培養(yǎng)液吸出，再每孔加入MTT 20 μL繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，棄上清液，不沖洗加入DMSO 150 μL充分溶解甲瓚結(jié)晶，37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的吸光度(A)值，計(jì)算各組的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值÷對照組A值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況

將A～F組的SH-SY5Y細(xì)胞以不含EDTA的胰酶消化后，室溫以1 000 r/min離心5 min，棄上清液；預(yù)冷后PBS重懸細(xì)胞，再次以1 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入Binding Buffer 100 μL重懸細(xì)胞后，加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，室溫下避光孵育15 min。上機(jī)前加入PI 10 μL進(jìn)行染色，每組加入PBS 400 μL后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 免疫印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞中P62、TDP43蛋白表達(dá)水平及LC3BⅡ/Ⅰ比值

將A～F組的SH-SY5Y細(xì)胞提取蛋白以后以每孔20 μg蛋白量等質(zhì)量上樣，以100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PDVF膜上。以體積分?jǐn)?shù)0.05的脫脂奶粉室溫封閉2 h后再分別加入TDP43抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。用TBST清洗PDVF膜3次，每次10 min，后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑顯影。采用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，檢測A～F組細(xì)胞的TDP43、P62蛋白表達(dá)水平及LC3BⅡ/Ⅰ比值情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 Western blot檢測3-MA阻斷自噬后細(xì)胞中TDP43蛋白表達(dá)水平

將研究分為無任何處理SH-SY5Y細(xì)胞組(A組)以及以0、50、50 μmol/L的GGA處理氧化應(yīng)激模型細(xì)胞24 h組(G～I(xiàn)組)，其中I組的細(xì)胞再以5 mmol/L的3-MA阻斷自噬，自噬強(qiáng)度以LC3BⅡ/Ⅰ比值表示。采用Western blot檢測A、G～I(xiàn)組細(xì)胞中TDP43蛋白的表達(dá)，并計(jì)算LC3BⅡ/Ⅰ比值情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色檢測細(xì)胞模型內(nèi)TDP43表達(dá)情況

細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色以后對照組SH-SY5Y細(xì)胞中TDP43蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，模型組SH-SY5Y細(xì)胞中TDP43蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1)，圖中紅色箭頭所指為SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TDP43蛋白異常聚集體。

圖1 SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TDP43蛋白表達(dá)情況比較(免疫化學(xué)染色，100 μm)

2.2 各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率和凋亡率比較

A～F組SH-SY5Y細(xì)胞存活率與凋亡率比較差異有顯著性(F=37.57、74.10，P<0.01)；其中D、E、F組的細(xì)胞存活率和凋亡率與C組比較均有顯著差異(q=4.11～14.24，P<0.01)。見表1。

2.3 各組SH-SY5Y細(xì)胞中TDP43、P62蛋白表達(dá)水平及LC3BⅡ/Ⅰ比值比較

A～F組SH-SY5Y細(xì)胞中TDP43、P62蛋白表達(dá)水平和LC3BⅡ/Ⅰ比值比較差異有顯著性(F=56.68～231.50，P<0.01)；D、E、F組TDP43、P62蛋白表達(dá)水平和LC3BⅡ/Ⅰ比值與C組比較比較有顯著差異(q=3.01～22.23，P<0.01)。見表1。

表1 GGA對各組細(xì)胞存活率、凋亡率、LC3BⅡ/Ⅰ比值及TDP43、P62表達(dá)的影響

2.4 3-MA阻斷自噬后各組細(xì)胞中TDP43 蛋白與LC3BⅡ/Ⅰ比值情況

A、G～I(xiàn)組細(xì)胞中TDP43蛋白表達(dá)水平分別為0.97±0.09、1.27±0.03、0.34±0.06、0.87±0.05。A、G～I(xiàn)組細(xì)胞當(dāng)中LC3BⅡ/Ⅰ比值分別為1.03±0.04、1.21±0.03、1.88±0.08、0.57±0.06。A、G～I(xiàn)組TDP43蛋白表達(dá)水平與LC3BⅡ/Ⅰ比值比較差異有顯著性(F=40.40，66.68，P<0.01)；I組與H組細(xì)胞中LC3BⅡ/Ⅰ比值及TDP43蛋白表達(dá)水平比較差異均有顯著性(q=16.02、6.12，P<0.01)。

3 討 論

神經(jīng)元胞質(zhì)中異常TDP43蛋白聚集為ALS的關(guān)鍵神經(jīng)病理學(xué)特征之一，異常TDP43蛋白聚集干擾神經(jīng)元正常功能以及其本身具有多種毒性[14-15]，是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行性丟失的主要原因[16]。近年來，一些能夠減輕異常TDP43蛋白聚集的策略引起了人們廣泛關(guān)注。有證據(jù)顯示在GFP-TDP-43和GFP-TDP-25轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞中阿霉素和秋水仙素能夠顯著清除TDP43蛋白聚集，并認(rèn)為這兩種藥物可能成為治療ALS的候選用藥[17]。最近研究表明，DJ-1(也稱為PARK7)基因過表達(dá)能夠通過抑制異常TDP43蛋白聚集，從而提高PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率[13]。因此抑制異常TDP-43蛋白聚集可能是治療ALS的一種潛在治療策略，這一觀點(diǎn)得到了上述研究的支持。在本研究中，觀察到GGA能夠抑制PQ誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中異常TDP43蛋白聚集。GGA的這種作用表明該化合物可能是治療和預(yù)防ALS的潛在候選治療藥物。

自噬是一種降解異常蛋白與受損細(xì)胞器的經(jīng)典途徑，是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。在ALS患者尸檢中發(fā)現(xiàn)，異常TDP43蛋白在神經(jīng)元中無法及時(shí)降解而大量蓄積且自噬能力受到不同程度受損，因而自噬功能障礙可能是TDP43蛋白無法降解的原因之一[18]。有證據(jù)表明氟桂利嗪、甲氨蝶呤能夠通過增強(qiáng)自噬促進(jìn)異常TDP43蛋白聚集的清除，從而提高小鼠神經(jīng)元、人干細(xì)胞源性神經(jīng)元以及攜帶突變的TDP43基因的星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活[19]。最近的一項(xiàng)研究顯示，海藻糖通過增強(qiáng)自噬而降低了轉(zhuǎn)染突變型TDP43基因的SH-SY5Y細(xì)胞中異常TDP-43蛋白表達(dá)水平[20-21]。雷帕霉素對ALS的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型均顯示出保護(hù)作用，如改善SQSTM1斑馬魚、ALS-TDP43果蠅模型和TDP43小鼠模型的疾病表型，清除異常TDP43聚集及減少神經(jīng)元死亡[8]。這些研究表明，通過啟動(dòng)自噬清除異常TDP43蛋白是治療ALS的一種有效策略。

GGA誘導(dǎo)熱休克相關(guān)蛋白的表達(dá)是其胃保護(hù)作用的重要機(jī)制之一[22]。GGA通過抗凋亡和誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，對脊延髓肌萎縮癥[23]、帕金森病[24]等退行性疾病的動(dòng)物模型均顯示出改善癥狀的作用。然而重復(fù)灌胃GGA的APP23轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠，其大腦中Aβ蛋白表達(dá)水平下降和Aβ斑塊沉積減輕。在APP23轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中并沒有檢測到HSP70蛋白表達(dá)水平升高。該研究認(rèn)為GGA可能是通過非依賴HSP70機(jī)制來達(dá)到改善效果[25]。同樣在本研究中，GGA能夠減輕PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y氧化應(yīng)激模型細(xì)胞中異常TDP43蛋白聚集，但GGA的具體作用的機(jī)制仍不清楚。有證據(jù)表明GGA能夠通過誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的腹膜炎大鼠的腹膜炎癥狀[26]。因此，GGA的這種作用可能與自噬有關(guān)。本研究結(jié)果示，GGA能夠在此模型中促進(jìn)LC3BⅠ向LC3BⅡ的轉(zhuǎn)換，同時(shí)減少異常聚集TDP43蛋白表達(dá)水平。而當(dāng)利用3-MA阻斷自噬以后，觀察到GGA降低TDP43蛋白表達(dá)水平的能力顯著減弱。這表明GGA可能通過增強(qiáng)自噬促進(jìn)異常TDP43蛋白的降解，自噬的激活可能是GGA發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，GGA通過增強(qiáng)自噬抑制PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y氧化應(yīng)激模型細(xì)胞中TDP43蛋白的異常聚集，這可能是GGA抑制異常TDP43蛋白聚集的機(jī)制之一。GGA的這種作用為其成為治療ALS的候選藥物提供了參考。