(青島大學附屬醫(yī)院乳腺病診療中心，山東 青島 266003)

乳腺癌是目前發(fā)病率較高的腫瘤之一[1]。在乳腺癌的綜合治療中，化療占有十分重要的地位。但多藥耐藥(MDR)即癌細胞同時對不同藥物產(chǎn)生交叉耐藥性仍然是化療成功的主要障礙[2]。在MDR的眾多原因中，由MDR1編碼的P-糖蛋白(P-gp)過表達發(fā)揮著重要作用，可在藥物到達細胞內靶點前即被攔截和排出胞外[3]。P-gp的過表達也會使乳腺癌細胞對治療中的許多常用藥物產(chǎn)生耐藥性，如蒽環(huán)類、紫杉類、長春堿類藥物等[4]。因此，逆轉MDR、提高患者的化療療效成為乳腺癌治療中最大的挑戰(zhàn)之一。上皮-間質轉化(EMT)是指上皮細胞轉化為間質細胞的過程。發(fā)生EMT的細胞失去極性，細胞間連接松散，并伴隨EMT標記物如N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(vimentin)表達的改變[5]，導致腫瘤細胞的遷移和侵襲能力增強，這是

腫瘤細胞發(fā)生轉移的潛在機制[6]。配對相關同源框1(PRRX1)已被證實為一個新的EMT的誘導因子，可使乳腺癌[7]、大腸癌[8]、胰腺癌[9]、胃癌[10]和頭頸癌[11]等腫瘤細胞發(fā)生EMT。其過表達可以增強乳腺癌細胞的遷移性和侵襲性[12]，但其在乳腺癌MDR中的作用鮮有報道。本研究旨在探討EMT誘導因子PRRX1在乳腺癌MDR中的作用及其分子機制，并為乳腺癌治療和預防提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞分組及瞬時轉染

乳腺癌細胞MCF-7購自中國科學院上海細胞研究所，將細胞接種于含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)并置于37 ℃含體積分數(shù)0.05的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合達80%以后分離接種于24孔板中，細胞按照處理方法不同分為3組，未處理的MCF-7細胞作為空白對照組(A組)，轉染空白pEX-3載體(上海吉瑪制藥技術有限公司)的MCF-7細胞作為陰性對照組(B組)，轉染攜帶PRRX1基因的重組質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司)的MCF-7細胞作為實驗組(C組)。B、C組細胞于轉染前1 d更換培養(yǎng)基，使用Lipofecta-mine 2000(美國Iivitrogen公司)試劑進行轉染。轉染48 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)及轉染情況。收集3組細胞(約9×105個/孔)用于后續(xù)相關基因和蛋白分析測定。

1.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測各組細胞當中PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gp mRNA的表達

從3組MCF-7細胞中提取總RNA并反轉錄成cDNA。然后采用Gene Amp 2400 PCR儀(美國PE公司)進行RT-qPCR。RT-qPCR的反應條件為：95 ℃預變性30 s；然后98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共進行40個循環(huán)；最后95 ℃延伸1 min。以β-Actin作為內參基因，使用2-△△CT方法計算各組細胞中PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gpmRNA的相對表達量。引物序列見表1。

1.3 WES蛋白質印跡定量分析系統(tǒng)檢測各組細胞PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gp蛋白的表達

以蛋白裂解液提取各組細胞的總蛋白以后，用BCA法測定蛋白濃度。將不同組別蛋白質溶液調成相同濃度。依照說明書將Ladder加入WES試劑盒檢測板第一行第1孔，其余24孔依次循環(huán)加入3組等濃度蛋白質溶液，第2行加入抗體稀釋液，第3行加入β-Actin、PRRX1、N-cadherin、Vimentin及P-gp一抗，第4行加入與各一抗對應的二抗，第5行加入發(fā)光液，最后加入緩沖液。離心并上機操作，運行完成后采用Compass軟件分析目標蛋白的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列和產(chǎn)物長度

1.4 CCK-8檢測細胞半數(shù)抑制濃度(IC50)

取對數(shù)生長期的3組MCF-7細胞(4 000個/孔)接種于96孔板中。細胞貼壁后加入化療藥物多西他賽和順鉑(北京索萊寶科技有限公司)。多西他賽的最終濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 μmol/L，順鉑的最終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 μmol/L。每個濃度設3個復孔，未加藥的孔作為對照孔，加不含細胞的完全培養(yǎng)基的孔為調零孔。加入藥物24 h后，每孔添加CCK-8試劑10 μL混合后，再放回培養(yǎng)箱孵育1 h，采用酶標儀于波長450 nm處測量各孔吸光度值。用GraphPad Prism 6軟件計算各組細胞的IC50。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 各組細胞的轉染情況

倒置熒光顯微鏡下觀察顯示，A組未見熒光(圖1A)，B組和C組均可見綠色熒光(圖1B、C)，轉染效率約為80%。A組和B組的細胞間均連接緊密，呈“鋪路石”狀(圖1D、E)，而C組細胞間連接松散，呈“紡錘形”(圖1F)。

2.2 各組細胞中PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gp mRNA及蛋白表達情況

3組細胞中的PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gpmRNA及蛋白表達水平比較差異均具有顯著性(F=7.08～23.39，P<0.05)。其中C組上述4種因子的 mRNA及蛋白表達水平均明顯高于A、B兩組(t=3.02～10.92，P<0.05)，A、B兩組比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.3 各組細胞多西他賽和順鉑處理后的IC50

多西他賽對A、B、C組細胞的IC50分別為0.45±0.06、0.44±0.06、1.29±0.14，順鉑對A、B、C組細胞的IC50分別為0.60±0.07、0.59±0.11、1.73±0.23，兩種藥物對3組細胞的IC50比較差異均具有顯著性(F=26.84、7.081，P<0.01)；其中兩種藥物對C組細胞的IC50明顯高于A、B兩組(t=4.54～5.68，P<0.05)；而兩種藥物對A、B組細胞的IC50比較差異無顯著性(P>0.05)。

A～C：A～C組細胞,熒光，200倍；D～F：A～C組細胞,普通光，200倍

表2 各組細胞PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gp mRNA及蛋白相對表達量比較

3 討 論

化療是乳腺癌最重要的治療手段之一，但由于患者易出現(xiàn)MDR而嚴重降低藥物療效，致使患者病情復發(fā)和預后不佳。逆轉腫瘤細胞的MDR對提高乳腺癌的治療效果至關重要，也是國內外學者高度關注的熱點[13-14]。

大量研究表明，EMT與化療藥物的耐藥有著密切的關系[15-17]。在EMT過程中，維持上皮表型的重要黏附分子被間質表型分子如N-Cadherin及vimentin所取代，從而導致細胞間黏附性降低，細胞遷移侵襲能力增強[18]。N-cadherin和vimentin不僅僅是EMT的重要標志物，目前發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的MDR也具有密切關系[19]。FISCHER等[20]研究顯示EMT可通過激活乳腺癌細胞中的乙醛脫氫酶來誘導其對環(huán)磷酰胺耐藥。SAXENA等[21]也發(fā)現(xiàn)EMT誘導物不僅可以增加腫瘤細胞的侵襲性，還可通過上調ABC轉運蛋白的表達，增加化療藥物的外排而致使耐藥的發(fā)生。LI等[22]發(fā)現(xiàn)阿霉素可誘導乳腺癌細胞系發(fā)生EMT和MDR，并且只有發(fā)生EMT的細胞侵襲性會增加并出現(xiàn)MDR，抑制EMT可逆轉其MDR。PRRX1是一種新發(fā)現(xiàn)的EMT誘導因子，能誘導癌細胞發(fā)生EMT并增加其侵襲性[7]。在乳腺癌中，PRRX1的表達與淋巴結轉移、臨床分期以及患者5年生存率顯著相關[23]。LV等[24]研究結果顯示PRRX1的主要亞型之一PRRX1b在三陰性乳腺癌中顯著上調，并與腫瘤大小和周圍血管的侵犯程度相關。PRRX1b的沉默可抑制基底樣癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結果顯示，PRRX1過表達可使乳腺癌MCF-7細胞系發(fā)生EMT改變，細胞間連結松散，細胞呈紡錘形，利于細胞運動遷移，并伴隨間質表型標志分子N-cadherin和vimentin表達的增加，這與先前的研究結果相符[5，7]。

然而PRRX1在MDR中的作用尚不清楚。最近的研究表明PRRX1高表達可誘導大腸癌EMT，與其轉移、預后不良及放療耐受相關[8，25]。而在肺癌細胞中沉默PRRX1可誘導EMT并增加肺癌細胞抗凋亡能力和對順鉑的耐藥性[26-27]。上述研究提示PRRX1在不同類型的癌癥細胞中發(fā)揮著不同的作用。本研究結果亦顯示，用多西他賽和順鉑分別處理乳腺癌MCF-7細胞24 h后，C組細胞的IC50值明顯高于A組和B組，提示PRRX1過表達可致使乳腺癌細胞發(fā)生MDR。在腫瘤細胞系中，ABC轉運蛋白的過表達可增加藥物外排從而降低細胞內藥物濃度，是腫瘤細胞獲得耐藥性最主要的機制之一[28-29]。由MDR1基因編碼的P-gp，又稱ABCB1，是研究最深入的ABC蛋白，長期以來被認為是克服腫瘤MDR的重要靶點[30]。P-gp不僅介導腫瘤細胞的MDR，而且參與調節(jié)其增殖、凋亡、遷移、侵襲及EMT等[31]。本研究通過RT-qPCR和WES蛋白定量分析系統(tǒng)檢測了3組細胞中P-gpmRNA和蛋白的相對表達量，結果顯示C組細胞的P-gpmRNA及蛋白表達水平較A、B兩組均明顯增高，提示PRRX1可能通過上調乳腺癌MCF-7細胞中P-gp的表達，介導MDR的發(fā)生。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)PRRX1過表達可通過誘導乳腺癌MCF-7細胞EMT而致使其發(fā)生MDR，對乳腺癌MDR發(fā)生機制的研究提供了新的思路。但MDR機制錯綜復雜，PRRX1參與這一過程的分子機制還有待進一步深入研究。