(1 青島大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院，山東 青島 266021； 2 中山大學腫瘤防治中心神經(jīng)外科； 3 青島大學藥學院)

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球女性癌癥死亡的主要原因。乳腺癌的不同分子亞型與其治療效果和預(yù)后密切相關(guān)，臨床上，根據(jù)受體表達情況，大致把乳腺癌分為Luminal A、Luminal B、三陰性型和HER-2過表達型4種亞型[1]。三陰性乳腺癌占所有乳腺癌病例的15%～20%[2]，因其侵襲性強、病情進展快等特點，給臨床上患者治療帶來嚴重的困難。目前三陰性乳腺癌的臨床治療方法主要是化療[3]，但化療后復(fù)發(fā)率高，且3年內(nèi)生存率低。此外，三陰性乳腺癌由于易發(fā)生侵襲性肺轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移，死亡率更高[4-6]。目前治療三陰性乳腺癌的化療藥物效果有限，且靶向治療藥物欠缺，因此亟待研究出新的治療三陰性乳腺癌的藥物。隨著天然藥物在抗腫瘤中的應(yīng)用，吲哚類藥物的研發(fā)日益引起人們的關(guān)注。2,3-吲哚醌又名吲哚-2,3-二酮，是抗癌藥物靛玉紅的衍生物，具有抗菌、抗真菌、抗腫瘤等多種生物學活性[7-9]，且分子結(jié)構(gòu)小、毒性低，具有開發(fā)為治療三陰性乳腺癌化療新藥的潛能。

細胞凋亡的失調(diào)是癌癥發(fā)病機制的一個重要的方面[10-11]。p53基因(p53)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白基因(Bax)調(diào)控的家族蛋白是重要的凋亡相關(guān)蛋白，也是治療癌癥的潛在靶點[12-13]。MDM2基因(MDM2)是一種致癌基因，還是腫瘤抑制因子p53最重要的負性調(diào)控因子，破壞p53與MDM2之間的相互作用，能使p53穩(wěn)定并激活[14]。因此，p53與MDM2之間互相調(diào)節(jié)，關(guān)系密切，可成為一個潛在的藥物作用靶點。本研究通過檢測BT549細胞中p53、Bcl-2、Bax以及MDM2 mRNA及蛋白的相對表達情況，探討2,3-吲哚醌對三陰性乳腺癌BT549細胞的抑制作用及分子機制，以期為2,3-吲哚醌的藥物研發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

乳腺癌BT549細胞購自中國科學院昆明細胞庫；2,3-吲哚醌購自美國Sigma公司； DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶消化液購自中國北京索萊寶科技有限公司；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒及引物購自北京全式金生物有限公司；BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體、P53、Bcl-2、Bax、MDM2抗體購自英國Abcam公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

使用含體積分數(shù)0.10胎牛血清以及0.01青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌BT549細胞，當培養(yǎng)瓶中細胞生長率達到60%左右的狀態(tài)時，加入梯度濃度2,3-吲哚醌后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至72 h。2,3-吲哚醌使用二甲亞砜溶解，根據(jù)實驗需要，使用時用培養(yǎng)基稀釋為相應(yīng)濃度。

1.3 2,3-吲哚醌對乳腺癌BT549細胞的抑制作用和毒性

在96孔板中常規(guī)培養(yǎng)BT549細胞，當96孔板中細胞的生長率達到60%左右時，分別加入0、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L 的2,3-吲哚醌(每個濃度值設(shè)置5個實驗復(fù)孔)，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，并放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化2 h，后使用酶標儀檢測各孔的吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次，取均值。根據(jù)抑制率公式計算2,3-吲哚醌對BT549細胞的抑制率，并采用SPSS統(tǒng)計軟件計算半數(shù)有效抑制濃度(IC50)。

1.4 2,3-吲哚醌對乳腺癌BT549細胞侵襲、遷移的抑制作用

1.4.1劃痕實驗 在6孔板之中常規(guī)培養(yǎng)BT549細胞，當生長率達到60%左右時，分別加入不同濃度2,3-吲哚醌(0、100、200、400 μmol/L)處理后繼續(xù)培養(yǎng)。細胞長滿后，用微移液管的尖端在每個孔中垂直和水平各畫2條線，并在不同的時間點(0、12、24 h)使用顯微鏡拍照，觀察劃痕愈合的情況。

1.4.2Transwell實驗 在24孔板當中常規(guī)培養(yǎng)BT549細胞，當生長率達到60%左右時，加入不同濃度2,3-吲哚醌(0、100、200、400 μmol/L)處理后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。將Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)液放置培養(yǎng)箱中孵育1 h后，使基質(zhì)膠凝固。將上述加藥培養(yǎng)后的細胞配成細胞懸液，于每孔上室加入100 μL細胞懸液，下室中加入600 μL含體積分數(shù)為0.10胎牛血清的培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，直至觀察到下室有細胞出現(xiàn)時終止培養(yǎng)。取出Transwell小室用PBS洗2次，甲醛固定，結(jié)晶紫染色5 min，PBS洗2次，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下拍照計數(shù)，每個濃度設(shè)置3個實驗復(fù)孔。

1.5 實時定量PCR(qPCR)方法檢測細胞中p53、Bcl-2、Bax、MDM2 mRNA相對表達量

常規(guī)培養(yǎng)BT549細胞，生長率達到60%左右時，分別加入0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌處理后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，采用trizol試劑提取BT549細胞的總RNA。RNA濃度測定后，進行PCR反轉(zhuǎn)錄和qPCR實驗，模板cDNA使用全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建，qPCR體系采用全式金試劑盒構(gòu)建。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 Western blot實驗檢測細胞中MDM2、Bcl-2、Bax、P53蛋白相對表達量

取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后加入0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌處理72 h，提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉2 h，加內(nèi)參照一抗和目標蛋白一抗(1∶1 000)在4 ℃條件下孵育過夜。然后使用1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗溶液孵育1 h，再次用1×TBST洗膜10 min，重復(fù)3次。最后將ECL發(fā)光液按說明書加到PVDF膜上，室溫放置1 min，放入成像系統(tǒng)顯影并拍照。以GAPDH的條帶結(jié)果為內(nèi)參照，將目的蛋白的條帶與內(nèi)參照進行比較，得出目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 2,3-吲哚醌對BT549細胞增殖的抑制作用

CCK-8實驗結(jié)果顯示，0～1 600 μmol/L組的細胞增殖率分別為1.00±0.00、0.98±0.04、0.92±0.02、0.81±0.04、0.62±0.04、0.43±0.02、0.21±0.06。與0 μmol/L組比較，2,3-吲哚醌的藥物濃度越高，BT549細胞的增殖率越低，差異具有統(tǒng)計學意義(F=74.64，P<0.01)。使用SPSS Statistics軟件計算得出2,3-吲哚醌對BT549細胞的IC50為609 μmol/L，最終篩選出0、100、200、400 μmol/L的2,3-吲哚醌為后續(xù)實驗的藥物濃度。

2.2 2,3-吲哚醌對BT549細胞侵襲和遷移的抑制作用

Transwell實驗顯示，0、100、200、400 μmol/L組細胞的侵襲率分別為92.00±1.15、58.00±1.15、22.33±1.45、16.33±1.33。與0 μmol/L組比較，隨著2,3-吲哚醌濃度的升高，BT549細胞的侵襲能力逐漸減弱(F=751.48，P<0.01)。見圖1。劃痕實驗結(jié)果表明，0、100、200、400 μmol/L組細胞的遷移率分別為0.80±0.01、0.72±0.03、0.45±0.02、0.21±0.03。與0 μmol/L組相比較，2,3-吲哚醌的濃度越高，BT549細胞的遷移能力越低 (F=314.67，P<0.01)。見圖2。

2.3 各組細胞中p53、Bcl-2、Bax、MDM2 mRNA相對表達量的比較

qPCR方法檢測結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比較，隨著2,3-吲哚醌濃度的逐步升高，細胞中p53及BaxmRNA的相對表達量逐漸增高(F=62.82、20.86，P<0.01)，Bcl-2、MDM2 mRNA相對表達量逐漸下降(F=21.53、30.31，P<0.01)。見表2。

表2 各組細胞中p53、Bcl-2、Bax、MDM2 mRNA相對表達量比較

2.4 各組細胞中P53、Bcl-2、Bax、MDM2蛋白相對表達量比較

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與0 μmol/L組比較，隨著藥物濃度增高，細胞中P53、Bax蛋白的相對表達水平逐漸增高(F=29.59、53.12，P<0.01)，Bcl-2和MDM2蛋白相對表達水平逐漸降低(F=14.85、159.81，P<0.01)。見表3、圖3。

A、B、C、D分別經(jīng)0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌處理

A、B、C、D分別經(jīng)0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌處理

表3 各組細胞中P53、Bcl-2、Bax、MDM2蛋白的相對表達量比較

圖3 Western blot實驗檢測各組細胞中相關(guān)蛋白的表達水平

3 討 論

三陰性乳腺癌約占乳腺癌的15%，在乳腺癌1型突變相關(guān)的患者中，80%以上發(fā)展為三陰性乳腺癌[15]。目前，三陰性乳腺癌的治療方法主要有手術(shù)、化療和放療，但手術(shù)風險高，化療敏感性較低，且易產(chǎn)生耐藥性，腫瘤復(fù)發(fā)率高[16]，嚴重地威脅著女性的健康，因此，開發(fā)靶向治療三陰性乳腺癌的新型藥物是科研人員的研究熱點，也是臨床上治療乳腺癌的迫切需要。

目前，三陰性乳腺癌的化療藥物主要是蒽環(huán)類、紫杉類和鉑類藥物，但是部分患者對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，且預(yù)后差，效果差強人意[17]。2,3-吲哚醌是一種內(nèi)源性生物因子，分布廣泛，具有多種生物活性和藥理活性[18]，其分子量小，化學結(jié)構(gòu)簡單，毒副作用小，具有開發(fā)為抗腫瘤藥物的潛能。研究表明，在抗癌藥物舒尼替尼和磷酸托塞拉尼布中，2,3-吲哚醌是其重要的藥效單位[19]。此外，2,3-吲哚醌還能抑制神經(jīng)母細胞瘤的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移[20]。2,3-吲哚醌的合成衍生物對乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231具有抗增殖的作用[21]?？梢姡?,3-吲哚醌與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。p53是一種重要的抑癌基因，可參與腫瘤的多種生物學過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[22]。p53是與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，大約50%的惡性腫瘤與p53的功能喪失有關(guān)[23]。2,3-吲哚醌發(fā)揮抑制腫瘤作用的分子機制是否與p53有關(guān)，目前尚不清楚。因此本研究主要探討2,3-吲哚醌能否通過P53信號通路來抑制三陰性乳腺癌BT549細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究中使用不同濃度的2,3-吲哚醌處理人乳腺癌BT549細胞72 h后，CCK8實驗檢測顯示，隨著2,3-吲哚醌濃度增加，細胞增殖明顯被抑制。Transwell實驗和劃痕實驗表明，2,3-吲哚醌對乳腺癌BT549細胞有明顯的抑制侵襲以及遷移的作用。qPCR和Western blot實驗分別檢測了加藥處理后，細胞中p53、Bax、Bcl-2和MDM2 mRNA相對表達量和P53、Bax、Bcl-2和MDM2蛋白相對表達量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53、BaxmRNA的相對表達量以及P53、Bax蛋白相對表達量逐漸升高，Bax和MDM2的mRNA相對表達量以及Bax、MDM2蛋白相對表達量逐漸降低，證明了2,3-吲哚醌很可能通過激活P53信號通路抑制乳腺癌BT549細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此研究為研發(fā)2,3-吲哚醌治療三陰性乳腺癌提供了基本的理論基礎(chǔ)，但只是在體外水平上驗證了2,3-吲哚醌對乳腺癌BT549細胞的作用，后續(xù)的體內(nèi)實驗及分子機制還需要進一步的研究。

綜上所述2,3-吲哚醌對三陰性乳腺癌BT549細胞具有明顯的抑制作用，且其機制可能是通過激活P53信號通路抑制細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，初步顯示了2,3-吲哚醌具有開發(fā)為治療三陰性乳腺癌化療新藥的潛能。