趙臨瀟，于東升，劉 希，王 雷，左博云

(1.延安大學(xué)咸陽醫(yī)院 病理科，陜西 咸陽712000；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科，陜西 西安710000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)是常見的婦科癌癥，好發(fā)于絕經(jīng)后婦女，以陰道異常出血和絕經(jīng)后出血為癥狀，大多數(shù)患者可在早期被診斷，預(yù)后良好，5年生存率可達80%-85%[1,2]；隨著人們生活方式的改變，在肥胖和高血糖等因素影響下，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率越來越高，也更趨于年輕化[3]。外科手術(shù)是EC治療的主要手段，包括子宮切除術(shù)、雙側(cè)輸卵管及卵巢切除術(shù)和淋巴結(jié)切除術(shù)等，主要取決于子宮頸、卵巢及淋巴結(jié)累及程度[2-4]。微小RNA(MicroRNA,miR)是一類在真核細(xì)胞中均存在的、內(nèi)源性、非編碼小RNA分子，能負(fù)性調(diào)控基因表達，進而參與細(xì)胞增殖、凋亡、癌變等生物過程[5，6]。既往研究表明，在多種腫瘤組織中，miR-381表達水平明顯降低，如乳腺癌、胃癌、膠質(zhì)瘤和乳頭狀甲狀腺癌[7-10]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)在腫瘤組織中高表達，能降低癌細(xì)胞的放療敏感性，增加腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力[11-12]。但miR-381與HMGB1的關(guān)系及兩者對EC的作用鮮有報道。本研究通過上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中miR-381表達水平，探討其對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，擬為EC的靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞株EM-E6/E7/TERT和子宮內(nèi)膜細(xì)胞癌細(xì)胞(Ishikawa、KLE、AN3CA、HEC1A和RL95-2)均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；胎牛血清(貨號：10437028)、DMEM(貨號：11965092)、DEME/F-12(貨號：11320082)和MEM培養(yǎng)基(貨號：11575032)均購自美國Gibco公司；實驗所用引物購自上海生工；CCK8試劑盒(貨號：C0037)購自碧云天生物技術(shù)公司；Trizol(貨號：10296028)總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen；E-cadherin(貨號：14472)、N-cadherin(貨號：4061)、Vimentin(貨號：3932)、Ki67(貨號：9449)、PCNA(貨號：2586)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (metalloproteinase-2,MMP-2)(貨號：4022)、MMP-9(貨號：3852)一抗購自美國Cell Signaling Technology，二抗(貨號：ab40772、ab18203、ab92547、ab197234、ab29、ab37150、ab38898)購自英國Abcam；Transwell小室(貨號：3477)購自美國Costar公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

將5種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞株分別培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，在37 ℃、含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般2天更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合度達到80%時可進行傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

接種細(xì)胞待細(xì)胞融合至90%，利用Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞在含有10%血清的培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 d進行后續(xù)實驗。

1.2.3實時定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR)收集細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，之后進行qRT-PCR。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變形10 s，60 ℃退火30 s，35個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，按照2-ΔΔCT法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.4熒光素酶報告實驗

采用生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan檢測發(fā)現(xiàn)miR-381和HMGB1存在連續(xù)的結(jié)合位點，再將HMGB1上該結(jié)合位點片段進行擴增，隨后克隆至熒光素報告酶載體pcDNA中，構(gòu)建HMGB1野生型(WT)質(zhì)粒。再利用基因位點突變技術(shù)將結(jié)合位點片段中部分核苷酸進行突變，構(gòu)建HMGB1突變型(MUT)質(zhì)粒。

將細(xì)胞分為4組(HMGB1 WT組、HMGB1 WT+miR-381 mimic組、HMGB1 MUT和HMGB1 MUT+miR-381 mimic組)，作相應(yīng)轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)試劑盒說明書裂解細(xì)胞并測定熒光素酶活性。

1.2.5細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)檢測細(xì)胞增殖能力

將細(xì)胞分為4組(HEC1A組、miR-381 mimc組、pc-HMGB1組和mimic+pc-HMGB1組)，作相應(yīng)轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)24、48和72 h，再加入CCK-8溶液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后檢測450 nm處吸光值(A)，計算細(xì)胞增殖倍數(shù)。以HEC1A細(xì)胞增殖的倍數(shù)來表示其它各組細(xì)胞增殖能力。

1.2.6Transwell實驗

將1×105個細(xì)胞接種于Transwell 小室上層，加入無血清培養(yǎng)基，在小室下層加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為化學(xué)誘導(dǎo)物，細(xì)胞分成4組(HEC1A組、miR-381 mimc組、pc-HMGB1組和mimic+pc-HMGB1組)，于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室用棉簽小心拭去基質(zhì)膠及上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫室溫染色25 min。顯微鏡下選5個視野進行拍照計數(shù)，計算平均每個視野的細(xì)胞數(shù)。

1.2.7細(xì)胞劃痕實驗

將1×105個細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達到90%時，用10 μl槍頭盡量垂直作線性劃痕，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌去除脫落細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞分成4組(HEC1A組、miR-381 mimc組、pc-HMGB1組和mimic+pc-HMGB1組)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，拍照記錄并測量劃痕寬度。劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.8Western blot檢測相關(guān)蛋白表達水平

將1×105個細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，細(xì)胞分成4組(HEC1A組、miR-381 mimc組、pc-HMGB1組和mimic+pc-HMGB1組)，培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度并調(diào)平，每組取30 μg蛋白用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，再用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(1∶500)于4 ℃封閉過夜。第2天洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h后，加入顯色液曝光顯影。

1.2.9統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-381在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞株和癌細(xì)胞系中的差異表達

與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞株相比，miR-381在5個子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中均存在低水平表達(P<0.01),見圖1。

圖1 miR-381表達水平

2.2 HMGB1是miR-381的直接靶點

生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-381-3p序列與HMGB1的3′-UTR端第358-364位點存在連續(xù)的互補片段(圖2A)。為了驗證兩者的靶向關(guān)系，采用熒光素酶報告實驗進一步確定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HMGB1 WT組相比，HMGB1 WT+miR-381mimic組熒光素酶活性明顯降低(P<0.01，圖2B)，而HMGB1 MUT組和HMGB1 MUT+miR381 mimic熒光素酶活性無明顯改變(P>0.05，圖2B)。

圖2 miR-381與HMGB1具有靶向關(guān)系

注：與HMGB1 WT組比較，**P<0.01。A：miR-381與HMGB1生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果；B：熒光素酶報告實驗證明miR-381與HMGB1存在靶向關(guān)系。

2.3 miR-381靶向抑制HMGB1表達

與HEC1A組相比，轉(zhuǎn)染miR-381 scramble后miR-381表達水平未見明顯改變(P>0.05，圖3A)，而轉(zhuǎn)染miR-381 mimic可顯著增加miR-381在HEC1A細(xì)胞中的表達水平(P<0.01，圖3A)；此外，轉(zhuǎn)染miR-381 mimic后，HMGB1的mRNA表達水平在HEC1A細(xì)胞中顯著降低(P<0.01，圖3B)。

蛋白印跡實驗結(jié)果表明，與HEC1A組相比，miR-381 mimic組HMGB1蛋白表達水平顯著降低(P<0.01，圖3C和3D)，pc-HMGB1組其表達則顯著增加(P<0.01，圖3C和3D)；而與pc-HMGB1組相比，mimic+pc-HMGB1組HEC1A細(xì)胞中HMGB1蛋白表達水平得到部分逆轉(zhuǎn)(P<0.01，圖3C和3D)。

2.4 miR-381靶向HMGB1抑制HEC1A細(xì)胞增殖

圖3 miR-381 mimic對HMGB1表達水平的影響

注：與HEC1A組比較，**P<0.01；與pc-HMGB1組比較，##P<0.01。A：miR-381表達水平；B：HMGB1的mRNA表達水平；C：HMGB1蛋白條帶圖；D：HMGB1的蛋白表達水平。

CCK8實驗檢測miR-381靶向HMGB1對HEC1A細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示：與HEC1A組相比，miR-381 mimic組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著降低(P<0.01，圖4A)，pc-HMGB1組細(xì)胞增殖倍數(shù)則顯著增加(P<0.01，圖4A)；與pc-HMGB1組相比，mimic+pc-HMGB1組細(xì)胞增殖倍數(shù)降低(P<0.01，圖4A)。此外，蛋白印跡實驗進一步檢測影響HEC1A細(xì)胞增殖能力的分子機制，結(jié)果顯示：與HEC1A組相比，miR-381 mimic組增殖相關(guān)蛋白Ki67和PCNA表達水平顯著降低(P<0.01，圖4B和4C)，pc-HMGB1組兩種蛋白表達水平則顯著增加(P<0.01，圖4B和4C)；與pc-HMGB1組相比，mimic+pc-HMGB1組細(xì)胞中Ki67和PCNA表達水平降低(P<0.01，圖4B和4C)。

圖4 HEC1A細(xì)胞增殖倍數(shù)和相關(guān)蛋白表達

注：與HEC1A組比較，**P<0.01；與pc-HMGB1組比較，##P<0.01。A：HEC1A細(xì)胞增殖倍數(shù)；B：增殖相關(guān)蛋白條帶；C：增殖相關(guān)蛋白表達結(jié)果。

2.5 miR-381靶向HMGB1抑制HEC1A細(xì)胞侵襲遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

Transwell實驗和劃痕閉合實驗分別檢測miR-381靶向HMGB1對HEC1A細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，結(jié)果顯示：與HEC1A組相比，miR-381 mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)量和劃痕閉合率均顯著降低(P<0.01，圖5A和5B)，pc-HMGB1組侵襲細(xì)胞數(shù)量和劃痕閉合率則均顯著增加(P<0.01，圖5A和5B)；與pc-HMGB1組相比，mimic+pc-HMGB1組侵襲細(xì)胞數(shù)量和劃痕閉合率均降低(P<0.01，圖5A和5B)。此外，蛋白印跡實驗檢測影響HEC1A細(xì)胞侵襲遷移和EMT能力的分子機制，結(jié)果顯示：與HEC1A組相比，miR-381 mimic組細(xì)胞低表達N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9而高表達E-cadherin(P<0.01，圖5C)，pc-HMGB1組則高表達N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9而低表達E-cadherin(P<0.01，圖5C)；與pc-HMGB1組相比，mimic+pc-HMGB1組5中蛋白表達水平均全部逆轉(zhuǎn)(P<0.01，圖5C)。

3 討論

在世界范圍內(nèi)，EC均是最常見婦科惡性腫瘤，在我國發(fā)病率僅次于宮頸癌；目前，臨床上對絕經(jīng)后陰道出血的婦女需經(jīng)陰道超聲檢查，評估子宮內(nèi)膜厚度以決定內(nèi)膜活檢的必要性，通常以5 mm為標(biāo)準(zhǔn)，但對無癥狀子宮內(nèi)膜增厚患者并不適用[13]。目前，EC的早期篩查和診斷依然存在困難，其治療主要以手術(shù)切除為主，但為了保留生育能力，保守治療仍是年輕女性的選擇之一。因此，尋找新的非手術(shù)治療方法是非常必要的。miRNAs是一種高度保守的非編碼RNA，長度約為18-22個核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平上可負(fù)向調(diào)控目的基因表達[14]。大量研究均表明，miRNAs在子宮內(nèi)膜癌發(fā)展進程中發(fā)揮著重要作用，可通過靶向調(diào)節(jié)目的基因?qū)崿F(xiàn)抑制或促進癌細(xì)胞生長[15-18]。且研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與EC發(fā)展呈負(fù)相關(guān)，抑制HMGB1表達能降低EC發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變，從而阻止癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]?；诖?，本研究首先檢測了miR-381在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞和多種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的表達差異，確定其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中低表達。之后，通過生物信息學(xué)預(yù)測miR-381和HMGB1的靶向關(guān)系并采用熒光素酶報告實驗加以證實。證明，miR-381過表達能靶向抑制HMGB1的mRNA和蛋白表達水平。

既往研究表明，miR-381可抑制癌細(xì)胞的增殖水平，如miR-381靶向成纖維細(xì)胞因子II型受體基因，從而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖能力[20]。Ki67和PCNA均是存在于增殖細(xì)胞核中的核蛋白，兩者高表達是細(xì)胞處于增殖水平的標(biāo)記[21,22]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-381抑制HEC1A細(xì)胞的增殖倍數(shù)，同時降低細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67和PCNA的蛋白表達水平，而共同轉(zhuǎn)染miR-381 mimic和pc-HMGB1部分逆轉(zhuǎn)了上述表現(xiàn)。綜合實驗結(jié)果表明，過表達miR-381對HEC1A細(xì)胞增殖能力的抑制作用，可能是通過靶向抑制HMGB1表達有關(guān)。而Tu等人[23]則認(rèn)為miR-381抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的作用，是通過靶向抑制胰島素樣生長因子受體1(insulin-like growth factor receptor 1,IGF-1R)實現(xiàn)的。

圖5 HEC1A細(xì)胞侵襲、遷移能力和相關(guān)蛋白表達

注：與HEC1A組比較，**P<0.01；與pc-HMGB1組比較，##P<0.01。A：Transwell實驗檢測HEC1A細(xì)胞侵襲能力；B：劃痕實驗檢測HEC1A細(xì)胞遷移能力；C：蛋白印跡實驗檢測相關(guān)蛋白表達水平。

此外，miR-381可抑制癌細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，如增加miR-381表達可通過靶向調(diào)控Twist1而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與遷移[24]；而靶向CXC 趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)能抑制乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[1]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時，上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin的表達明顯下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)記蛋白N-cadherin和Vimentin的表達則明顯上升[25]。此外，MMP-2和MMP-9在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，有利于腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生[26]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-381能抑制HEC1A細(xì)胞的侵襲和遷移能力，同時調(diào)節(jié)侵襲、遷移和EMT相關(guān)蛋白表達水平，而過表達HMGB1則正好相反，且共同轉(zhuǎn)染miR-381 mimic和pc-HMGB1部分逆轉(zhuǎn)了過表達HMGB1對腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和EMT的影響。綜合實驗結(jié)果顯示，miR-381可能通過靶向抑制HMGB1表達水平，從而抑制HEC1A細(xì)胞的侵襲、遷移和EMT能力。但是，過表達miR-381對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制作用是否還存在其他靶基因的表達改變，還需要進一步篩查和研究。

綜上所述，HMGB1是miR-381的直接靶點；過表達miR-381能抑制HMGB1的mRNA和蛋白表達水平；抑制細(xì)胞增殖能力和相關(guān)蛋白Ki67、PCNA的表達；降低細(xì)胞侵襲、遷移能力，并調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的表達。表明，miR-381的表達上調(diào)通過靶向調(diào)控HMGB1的表達，抑制了子宮內(nèi)膜癌HEC1A細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。下一步將研究過表達miR-381靶向HMGB1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移作用，以期為子宮內(nèi)膜癌的治療提供思路。