邱志東，王雪紅，孫維佳，金俊飛

(1.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院 普通外科，廣東 深圳518081；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽胰外科實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林541001;3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙410008)

原發(fā)性肝癌(PLC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中主要以肝細(xì)胞肝癌(HCC，簡稱肝癌)為主，這也是威脅我國公民健康的主要病理類型[1]。盡管近些年來肝癌的診斷和治療水平不斷提高，但是肝癌的總體治療效果仍不盡如人意。因此尋找新的診療靶標(biāo)具有重要的意義。

干預(yù)神經(jīng)酰胺(Cer)信號(hào)通路、抑制細(xì)胞死亡是細(xì)胞逃逸凋亡、導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一[2-4]。研究表明Cer的代謝通路與肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系[5,6]。眾所周知，Cer的代謝非常復(fù)雜[7]，在Cer代謝過程中，除Cer外，還產(chǎn)生很多與Cer相關(guān)的生物活性分子，比如神經(jīng)鞘磷脂(SM)、神經(jīng)鞘氨醇(SPH)以及1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇(S1P)等。Cer和Sph能夠抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，S1P則刺激細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡[8]。S1P lyase是 S1P裂解酶，其在調(diào)控S1P水平中起重要作用[7]。本研究旨在探討S1P lyase在肝癌中的表達(dá)及其對(duì)肝癌預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本和臨床資料

收集54例2015-2019年在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的肝癌患者術(shù)后標(biāo)本，所有病例的臨床和病理診斷均為HCC，選取的癌旁組織與癌灶距離>1 cm，記錄患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期等臨床數(shù)據(jù)。54例患者中男性患者45例，女性患者9例，年齡25-72歲，平均年齡(51.54±10.96)，病理分級(jí)1級(jí)10例、2級(jí)27例、3級(jí)8例、4級(jí)4例，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移40例，無轉(zhuǎn)移14例，所有患者均在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)治療，術(shù)前均未進(jìn)行放、化療，無合并其它腫瘤，腫瘤分期依據(jù)采用國際抗癌聯(lián)盟第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。所有樣本都在樣本離體后第一時(shí)間置于液氮，然后迅速置于-80℃冰箱凍存待用。所有肝癌樣本的獲取均取得患者本人及其家屬的同意，并通過桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TRIzol 試劑購于Life Technologies (Gaithersburg,MD)，TB Green Premix 購于 TaKaRa(Tokyo,Japan)，F(xiàn)astQuant RT Kit (with gDNase) 購于天根 (中國北京)。

1.3 方法

1.3.1提取組織RNA及real-time PCR剪刀剪取50-100 mg的組織，在樣品組織破碎儀下打碎組織。TRIZOl法提取組織中的總RNA，利用FastQuant RT kit (with gDNase)試劑盒合成cDNA。按照real-time PCR試劑盒的要求進(jìn)行real-time PCR。每孔的反應(yīng)體系如下：cDNA 2.0 μl,引物0.1 μM，TB Green Premix 12.5 μl，去酶水9.5 μl?；虮磉_(dá)量采用2(-△△CT) 的相對(duì)表達(dá)量法，GAPDH作為內(nèi)參基因(表1)。

表1 引物序列

1.3.2Kaplan-Meier生存分析 根據(jù)Kaplan-Meier(www.kmplot.com)的分析結(jié)果，以無復(fù)發(fā)生存率(RFS)來評(píng)估S1P lyase在評(píng)價(jià)肝癌患者生存預(yù)后的價(jià)值。

1.3.3蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將S1P lyase導(dǎo)入到STRING(version 11.0)的數(shù)據(jù)庫，得到一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)。利用軟件參數(shù)將神經(jīng)鞘脂信號(hào)通路相關(guān)蛋白標(biāo)出。

1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以配對(duì)t檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及方差分析評(píng)價(jià)定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S1P lyase在肝癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織

我們隨機(jī)選取了54例肝細(xì)胞癌患者手術(shù)切除的癌及癌旁組織，采用real-time PCR 檢測(cè)S1P lyase在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(見圖1)，S1P lyase在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(P<0.05)。

T：肝癌組織，ANLT：癌旁組織，P**<0.05。

2.2 S1P lyase的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)合所選取病例的臨床資料，我們進(jìn)一步分析了S1P lyase的表達(dá)與肝癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性(表2、圖2)。表2結(jié)果顯示：S1P lyase mRNA表達(dá)水平與腫瘤大小及腫瘤分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是與患者年齡、性別、病理分級(jí)及轉(zhuǎn)移無關(guān)；圖2A結(jié)果顯示，大于10 cm的腫瘤和小于10 cm的腫瘤相比，S1P lyase的表達(dá)明顯降低(P**<0.05)，另外，圖2B結(jié)果顯示，在肝癌AJCC分期(第8版)為3期及4期的患者中，S1P lyase的表達(dá)明顯比1期及2期的患者降低。

2.3 S1P lyase的低表達(dá)能夠預(yù)測(cè)肝癌患者術(shù)后的遠(yuǎn)期生存率

我們通過Kaplan-Meier分析S1P lyase的表達(dá)與肝癌病人預(yù)后的相關(guān)性(圖3)。結(jié)果顯示，S1P lyase表達(dá)量越低，肝癌病人預(yù)后越差(HR=0.65,P=0.017)。

表2 S1P lyase表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

注：2個(gè)樣本之間的比較運(yùn)用t檢驗(yàn)(t)，3個(gè)樣本的比較運(yùn)用方差分析(F)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法參考文獻(xiàn)[9]。

2.4 潛在與S1P lyase存在相互作用的神經(jīng)鞘脂信號(hào)通路蛋白

我們利用STRING數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)了與S1P lyase相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)位于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)位置的蛋白多與膜脂代謝、神經(jīng)鞘脂代謝、神經(jīng)酰胺代謝、膜脂合成、神經(jīng)鞘脂合成通路相關(guān)。其中S1Plyase與神經(jīng)鞘脂代謝通路有互作的蛋白有CERS2、CERS4、CERS5、CERS6、SGPP1、SGPP2、ORMDL1、ORMDL2及ORMDL3。

3 討論

在全世界的腫瘤中，肝癌發(fā)病率第5位，死亡率第4位[10]。2018年全球新增肝癌病人84.1萬人，死于肝癌患者78.2萬人[10]。而我國肝癌發(fā)病病例、死亡病例均占全球總病例數(shù)一半以上[11，12]。絕大多數(shù)肝癌患者確診時(shí)已為中晚期，此類患者手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率高，生存率低，因此針對(duì)中晚期肝癌進(jìn)行深入研究，尋找除手術(shù)之外的治療手段及診療靶點(diǎn)意義重大。

A：S1P lyase表達(dá)與肝癌腫瘤體積的關(guān)系，P**<0.05；B：S1P lyase表達(dá)與肝癌分期的關(guān)系，P***<0.01。

圖3 S1P lyase的表達(dá)與肝癌病人預(yù)后的關(guān)系

S1P是神經(jīng)鞘脂信號(hào)通路的重要生物分子，S1P主要通過其5種細(xì)胞表面受體(S1PR 1-5)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[13],通過和相應(yīng)的受體結(jié)合參與血管生成[14-16]及促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活[17，18]。S1P由SK磷酸化SPH生成的,同時(shí)又可以被S1P lyase裂解成為乙醇胺和軟脂醛。Uranbileg B等[19]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SK(由SPH合成S1P所需的酶)和S1P lyase(S1P裂解酶)表達(dá)均上調(diào)的情況下，S1P水平不是增高而是下降，說明S1P lyase是調(diào)控S1P水平的關(guān)鍵酶。我們的研究結(jié)果表明，S1P lyase在肝癌中的表達(dá)下降，說明在肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程中，S1P lyase可能出現(xiàn)了基因表達(dá)的缺失，S1P lyase可能是一種抑癌基因。

然而S1P lyase是在肝癌的早期還是晚期中發(fā)揮作用呢？我們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，S1P lyase的表達(dá)與肝癌腫瘤的體積大小及分期相關(guān)，體積>10 cm的腫瘤中S1P lyase的表達(dá)更低，提示S1Plyase低表達(dá)可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖能力。作為調(diào)控S1P水平的關(guān)鍵酶，S1Plyase表達(dá)下降，會(huì)引起S1P水平的升高，而S1P水平增高可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，因此推測(cè)S1P lyase可能通過調(diào)控S1P水平影響肝癌的增殖。眾所周知，腫瘤的大小通常影響肝癌患者的預(yù)后，AJCC第8版肝癌分期更是把多發(fā)腫瘤直徑>5 cm設(shè)為T3[20,21]，而巨大肝癌的患者常預(yù)示著腫瘤已進(jìn)入晚期階段，治療效果較差，因此S1P lyase水平下降可能在晚期肝癌中發(fā)揮更重要的作用。我們的進(jìn)一步研究結(jié)果表明，S1P lyase在AJCC分期3期及4期的患者中表達(dá)更低，說明S1P lyase可能在晚期肝癌中發(fā)揮作用，S1P lyase表達(dá)水平的下降可能在促進(jìn)肝癌的發(fā)展中起重要作用。

與此同時(shí)，我們通過Kaplan-Meier分析S1P lyase的表達(dá)與肝癌病人預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示，S1P lyase表達(dá)量越低，肝癌病人預(yù)后越差。因此S1P lyase表達(dá)下降可以作為肝癌不良預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。

然而，作為神經(jīng)鞘脂信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵酶，S1P lyase發(fā)揮作用的方式可能不僅僅是直接裂解底物，進(jìn)而影響S1P水平發(fā)揮作用。神經(jīng)鞘脂信號(hào)通路的諸多蛋白可能存在相互作用，進(jìn)而整體上影響某一種神經(jīng)鞘脂分子的水平。我們利用STRING數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)了與S1P lyase相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)位于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)位置的蛋白多與膜脂代謝、神經(jīng)鞘脂代謝、神經(jīng)酰胺代謝、膜脂合成、神經(jīng)鞘脂合成通路相關(guān)。其中與神經(jīng)鞘脂代謝通路相關(guān)的蛋白有CERS2、CERS4、CERS5、CERS6、SGPP1、SGPP2、ORMDL1、ORMDL2及ORMDL3。這些蛋白中CERS2、CERS4、CERS5、CERS6為Cer合成酶[22]，SGPP1、SGPP2可以將S1P去磷酸化生成SPH[23]，而ORMDL1、ORMDL2及ORMDL3則能負(fù)向調(diào)控神經(jīng)鞘脂代謝通路[24]。

綜上所述，S1P lyase在肝癌中低表達(dá)，而S1P lyase 低表達(dá)預(yù)示著肝癌患者的不良預(yù)后，因此S1P lyase可能是中晚期肝癌患者重要的治療靶點(diǎn)。但是本研究僅是對(duì)S1P lyase的初步研究，還應(yīng)從細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究中進(jìn)一步探討S1P lyase在肝癌發(fā)展中作用及機(jī)制。