趙 慧

天津市河西區(qū)口腔醫(yī)院藥劑科(天津 300000)

靈芝為擔(dān)子菌綱，多孔菌科、靈芝屬真菌的總稱[1]。《中華人民共和國藥典》2015年版收載的靈芝藥材是赤芝[Ganodermalucidum(Leys.ex Fr.)Karst]或紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd]的干燥子實(shí)體[2]。具有補(bǔ)中益氣、延年益壽、扶正固本、滋陰強(qiáng)壯等功效[3]?？茖W(xué)研究證實(shí)[4]，靈芝多糖類和三萜類是其主要的藥理活性成分?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版中以靈芝多糖含量的高低作為評(píng)價(jià)靈芝質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一,日本等國家則以靈芝酸含量的高低來控制靈芝的質(zhì)量[5]。

近年來隨著靈芝在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等方面的作用逐步被人們所認(rèn)識(shí)，市場(chǎng)上的靈芝產(chǎn)品日益增多，靈芝保健品、藥用產(chǎn)品不斷升溫，靈芝藥材的市場(chǎng)需求量也日益增大，然而,野生靈芝資源有限,人工栽培的靈芝由于產(chǎn)地、栽培技術(shù)、采收條件等的差異,導(dǎo)致市場(chǎng)上的靈芝產(chǎn)品良莠不齊，本實(shí)驗(yàn)選取了靈芝的道地產(chǎn)區(qū)安徽大別山區(qū)的兩種靈芝以及山東和東北兩大人工栽培靈芝的主要產(chǎn)區(qū)的靈芝，從靈芝總多糖的含量和靈芝酸類成分HPLC指紋圖譜兩方面對(duì)這幾個(gè)產(chǎn)地的靈芝的質(zhì)量進(jìn)行研究，從而為靈芝原料的采購提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所用靈芝分別為安徽大別山松杉靈芝、安徽大別山密紋靈芝、東北赤芝、山東紫芝(采集時(shí)間：2018年10月)，經(jīng)黃崔生教授鑒定均符合藥典要求的赤芝和紫芝類。

1.2儀器與試劑Agilent 1200高效液相色譜儀；UV-1206紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；AEL-200電子天平(xiangxiBanlance factory)；AB204-N分析天平(梅特勒托利多儀器公司)；葡萄糖對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所)；乙腈(色譜級(jí))；磷酸(分析純)；香草醛(分析純)；冰醋酸(分析純)等。

2 方法與結(jié)果

2.1靈芝多糖含量測(cè)定參照《中國藥典》2015年版一部中靈芝多糖的含量測(cè)定方法，建立了適合本實(shí)驗(yàn)樣品的靈芝多糖含量測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)采用索氏提取法對(duì)靈芝多糖進(jìn)行提取，蒽酮-硫酸法測(cè)定其含量，并對(duì)線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收進(jìn)行了考察。

2.1.1 靈芝多糖的含量測(cè)定方法 ①對(duì)照品溶液的制備。取一定量的葡萄糖對(duì)照品105℃干燥至恒重，精密稱取10 mg，用重蒸水溶解，定容至100 mL制成0.1 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。②供試品溶液制備。取靈芝藥材粉末2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加水90 mL，移置電熱套中，加熱回流提取至提取液無色，將提取液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取提取液10 mL，置250 mL具塞三角瓶中，加入乙醇150 mL，搖勻，4℃放置12 h，取出，離心，棄去上清液，沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。③含量測(cè)定方法。精密吸取供試品溶液2 mL,置10 mL具塞試管中，精密加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.1 g,加入80%的硫酸溶液100 mL,使溶解，即得)6 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，依照紫外-可見分光法在625 nm處測(cè)定吸收值。

2.1.2 靈芝多糖含量測(cè)定的方法學(xué)考察 ①線性關(guān)系的考察。分別精密吸取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置10 mL具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在625 nm的波長處測(cè)定吸收度，以吸收值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.004 6x+0.018 1(r=0.999 2)，葡萄糖的加入量在20～120 μg的范圍內(nèi)與吸收度呈良好的線性關(guān)系。②精密度試驗(yàn)。分別精密吸取同一葡萄糖對(duì)照品溶液(0.1 mg/mL)0.6 mL,依照上述顯色方法，重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得吸收值的平均值為：0.323，RSD為：2.00%(n=6)，表明本方法葡萄糖對(duì)照品的顯色重復(fù)性良好。③重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批靈芝樣品6份，60℃干燥后粉碎，精密稱取靈芝粉末2 g，按照2.1.1②供試品溶液的制備方法制備供試品，分別吸取供試品溶液0.2 mL,依照上述含量測(cè)定方法進(jìn)行靈芝多糖的含量測(cè)定，測(cè)得吸收值的平均值為：0.325，RSD值為：1.28%，表明此方法重復(fù)性良好。④穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.6 mL，依照2.1.1③的含量測(cè)定方法顯色，分別在顯色后5，10，15，20，25，30 min時(shí)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的吸收值平均值為：0.324，RSD為:0.57%(n=6),表明該方法穩(wěn)定性良好。⑤加樣回收試驗(yàn)。本方法因無靈芝多糖對(duì)照品而以葡萄糖為對(duì)照品。多糖提取采用的是水提醇沉法，葡糖糖用乙醇無法使其沉淀，故用葡糖糖對(duì)照品溶液直接加入靈芝多糖提取液的辦法進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)。

精密量取0.2 mL已知含量的靈芝多糖濃縮液9份，分為3組，分別精密加入濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖對(duì)照品溶液0.4、0.5、0.6 mL,按照上述含量測(cè)定方法測(cè)定其含量,計(jì)算回收率?；厥章史秶?8.53%～103.58%平均回收率為100.22%，RSD為1.78%，表明此方法回收率符合要求，見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.1.3 不同品種靈芝藥材中靈芝多糖含量比較 按照2.1.1③靈芝多糖的含量測(cè)定方法對(duì)4個(gè)產(chǎn)地的靈芝進(jìn)行靈芝多糖的含量測(cè)定，見表2。

表2 不同產(chǎn)地靈芝藥材中靈芝多糖的含量比較

2.2不同品種靈芝子實(shí)體靈芝酸類成分HPLC指紋圖譜

2.2.1 供試品溶液[6]的制備 稱取靈芝藥材3 g加無水乙醇150 mL熱回流提取2 h，過濾，殘?jiān)贌o水乙醇150 mL回流2 h，共重復(fù)提取3次，濾液合并，減壓蒸干后加氯仿15 mL溶解，移至分液漏斗中，再用氯仿洗滌殘?jiān)?次，合并氯仿液；用飽和碳酸氫鈉萃取氯仿4次(15 mL×4)，合并碳酸氫鈉液，用6 mol/mL鹽酸調(diào)節(jié)pH 2～3，用氯仿萃取4次(15 mL×4)，合并氯仿液，用水洗滌氯仿液，棄去水層，氯仿液用無水硫酸鈉干燥，過濾，用氯仿洗滌無水硫酸鈉3次(15 mL×3)，洗滌液與濾液合并，減壓蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，過微孔濾膜。

2.2.2 色譜條件 流動(dòng)相:乙腈和水梯度洗脫,梯度洗脫程序見表3;色譜柱:capcellC18柱;檢測(cè)波長：254 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量：30 μL;流速：0.8 mL/min。

表3 梯度洗脫表

2.2.3 試驗(yàn)結(jié)果 4個(gè)產(chǎn)地靈芝的靈芝酸HPLC指紋圖譜見圖1～4。

圖1 大別山密紋靈芝

圖2 大別山松杉靈芝

圖3 東北赤芝

圖4 山東紫芝

3 討論

靈芝多糖具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、消除體內(nèi)自由基、降血糖、降血脂等作用[7]，本實(shí)驗(yàn)利用蒽酮-硫酸法對(duì)靈芝的多糖含量進(jìn)行測(cè)定，其中安徽大別山松杉靈芝多糖含量最高(16.37 mg/g)，其它品種的靈芝多糖含量從高到低依次為：安徽大別山密紋靈芝(15.83 mg/g)，東北赤芝(15.29 mg/g)，山東紫芝(14.96 mg/g)。靈芝三萜在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤方面顯著效果[4]，其含量的高低直接決定了靈芝產(chǎn)品抑腫瘤效果的好壞。本實(shí)驗(yàn)利用HPLC法測(cè)定了4個(gè)品種靈芝的靈芝酸類成分指紋圖譜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4個(gè)品種靈芝的靈芝酸類成分指紋圖譜具有明顯差異。

本實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)了靈芝的藥效物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明由于地理氣候條件等許多因素的影響，各品種靈芝質(zhì)量存在差異，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為靈芝原料的采購提供可靠的理論依據(jù)。