曹 聰 黃桂柳 黃贊松 胡高裕 鄧志華 李廣志 陸文權(quán) 鐘秋紅

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院1 全科醫(yī)學科，2 消化內(nèi)科，廣西百色市 533000，電子郵箱：281261971@qq.com；3 廣西百色市那坡縣人民醫(yī)院內(nèi)科，那坡縣 533900；4 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院超聲科，廣西百色市 533000)

我國是肝癌高發(fā)區(qū)，據(jù)2012年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計，我國肝癌病例數(shù)約占全球總例數(shù)的一半[1]，2015年我國肝癌新發(fā)病例約47萬，新增死亡病例約42萬[2]。中晚期肝癌患者的首選治療方式是肝動脈化療栓塞術(shù)，但對化療藥物耐藥往往是導致治療失敗的主要原因之一。因此，尋找提高腫瘤細胞對化療藥物敏感性的藥物具有重要意義。姜黃素是一種多酚類化合物，其具有抗炎[3-4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6-7]、逆轉(zhuǎn)化療耐藥[8-9]等多種作用，但其具體機制尚未明確。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)是絲裂原活化蛋白激酶相關(guān)信號通路的主要通路之一，有研究證實其與肝癌化療耐藥相關(guān)[10]。故本研究探討姜黃素對HepG2/ADM細胞增殖的抑制作用，并基于p38MAPK信號通路分析其逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 人肝癌耐藥細胞株HepG2/ADM購自廣州吉妮歐生物有限公司，其親本株HepG2購自中國科學院上海細胞庫，均由本實驗室進行培養(yǎng)、傳代與凍存。姜黃素購自美國Sigma公司(批號：C1386-10G)，RPMI-1640培養(yǎng)基(批號：A4192301)及胎牛血清(批號：1982158C)購自美國Gibco公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT；批號：M8180)、胰酶(批號：T1350)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate-buffered saline,PBS；批號：P1020)均購自北京索萊寶公司，阿霉素購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司(批準文號：國藥準字 H44024359)，含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液(批號：P0013B)、二喹啉甲酸蛋白定量測定試劑盒購自上海碧云天公司(貨號：P0010S)。磷酸化p38MAPK蛋白兔抗人單克隆抗體購自Abcam公司(批號：ab4822)，內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(貨號：BA2913)購自武漢博士德公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋公司(羊抗兔貨號：ZB-2305，羊抗鼠貨號：ZB-2301)。

1.2 細胞培養(yǎng) 于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)HepG2細胞。含0.5 nmol/mL濃度阿霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基用于培養(yǎng)耐藥細胞HepG2/ADM以維持耐藥性，正式實驗前1周撤去阿霉素，改用不含阿霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。兩株細胞均置于37℃、 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

1.3 姜黃素對HepG2/ADM細胞增殖抑制作用的評估 將HepG2/ADM細胞分為不同濃度藥物組、陰性對照組及空白對照組。實驗步驟：(1)細胞培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的HepG2/ADM細胞，消化細胞后進行細胞計數(shù)，取100 μL細胞接種于96孔板中(空白對照組只加入等量完全培養(yǎng)基不接種細胞)，細胞密度為1×104個細胞/孔。(2)藥物干預。待細胞貼壁后，取出細胞，棄掉舊培養(yǎng)基，藥物組加入含不同濃度姜黃素(濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL)的培養(yǎng)基200 μL，陰性對照組及空白對照組加入不含藥物的RPMI-1640完全培養(yǎng)基200 μL。(3)MTT法檢測細胞增殖情況。將細胞置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48及72 h后棄上清液，每孔加入5 mg/mL的 MTT溶液15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出各組細胞，棄上清液后各孔加入150 μL二甲基亞砜，并置于37℃恒溫搖床孵育、震蕩，10 min后于酶標儀(Thermo公司，型號：Multiskan MK3)上測定492 nm處吸光度值(A值)。(4)結(jié)果計算。根據(jù)A值計算姜黃素對細胞的抑制率，以空白對照組作為調(diào)零孔，實驗組A值=藥物組A值-空白對照組A值，對照組A值=陰性對照組A值-空白對照組A值，抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4 HepG2/ADM細胞耐藥性檢測及姜黃素逆轉(zhuǎn)耐藥性實驗 將HepG2細胞、HepG2/ADM細胞分為藥物組、陰性對照組及空白對照組進行實驗。實驗步驟：(1)細胞培養(yǎng)，方法同1.3。(2)藥物干預。HepG2細胞藥物組加入200 μL不同濃度阿霉素(0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL)；HepG2/ADM細胞藥物組分兩組，一組加入含不同濃度阿霉素(1.5 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL、12 μg/mL、24 μg/mL)的完全培養(yǎng)基200 μL，一組加入姜黃素(5 μg/mL)+不同濃度阿霉素(1.5 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL、12 μg/mL、24 μg/mL)200 μL；兩種細胞的陰性對照組及空白對照組加入不含藥物的RPMI-1640完全培養(yǎng)基200 μL。于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。(3)MTT法檢測細胞增殖，方法同1.3。(4)結(jié)果計算。根據(jù)A值計算各組細胞抑制率，利用SPSS 17.0軟件計算阿霉素的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)，即抑制 50%細胞生長的藥物濃度，用于評價細胞對阿霉素的敏感性。耐藥指數(shù)(resistance index,RI) =耐藥細胞IC50/親本細胞IC50，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細胞IC50/姜黃素干預后耐藥細胞IC50。耐藥程度根據(jù)文獻[11]進行判斷，<5為低度耐藥，5～15為中度耐藥，>15為高度耐藥。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測磷酸化p38MAPK蛋白的表達 根據(jù)1.3及1.4實驗結(jié)果，采用5 μg/mL的姜黃素、IC50的阿霉素進行下一步實驗，將HepG2/ADM細胞分為對照組(接種細胞，不加任何藥物，只加入2 mL完全培養(yǎng)基)、阿霉素組(14 μg/mL阿霉素2 mL)、姜黃素組(5 μg/mL姜黃素2 mL)、阿霉素與姜黃素聯(lián)合組(14 μg/mL阿霉素+5 μg/mL姜黃素，均為2 mL)。各組細胞經(jīng)藥物作用48 h后，棄上清液，用預冷的PBS液沖洗細胞3次，加入200 μL含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液后收集細胞至1.5 mL離心管中，冰上孵育20 min后于12 210 r/min、4℃離心10 min，取部分上清液使用BCA法測定蛋白濃度。按常規(guī)方法制膠(分離膠12%，濃縮膠5%)，以25 μg/孔上樣蛋白后進行電泳，電泳后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氯乙烯膜上，轉(zhuǎn)膜后TBST漂洗 2次，加入適量封閉液(碧云天公司，批號：P0023B)，于室溫中封閉1～2 h。封閉結(jié)束后加入相應一抗(稀釋體積比：磷酸化p38為1 ∶500，內(nèi)參為1 ∶1 000)，于4℃冰箱中孵育過夜。次日取出聚偏二氯乙烯膜，TBST洗膜3～5次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋體積比：1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，使用TBST洗5次后采用電化學發(fā)光法曝光X膠片。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對人肝癌細胞HepG2/ADM增殖的抑制作用 在各個作用時間點，不同濃度姜黃素組間細胞增殖抑制率差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。其中，姜黃素分別作用48 h、72 h后，HepG2/ADM細胞的增殖抑制率隨著濃度的增加而增加(均P<0.05)；姜黃素作用24 h后，5 μg/mL姜黃素組與10 μg/mL姜黃素組組間細胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其他各濃度組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。各濃度姜黃素組中，不同干預時間之間細胞增殖抑制率差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。其中，5、10、20、40 μg/mL姜黃素作用下HepG2/ADM細胞的增殖抑制率隨著作用時間的延長而增加(均P<0.05)；而5 μg/mL、40 μg/mL與60 μg/mL姜黃素作用下，作用24 h后和作用48 h后的細胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但均低于作用72 h后的細胞增殖抑制率(均P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度姜黃素干預不同時間后HepG2/ADM細胞的增殖抑制率(x±s，%)

2.2 HepG2/ADM細胞對阿霉素的耐藥性及姜黃素的逆轉(zhuǎn)作用 根據(jù)阿霉素作用于兩種細胞48 h后的MTT結(jié)果，阿霉素對HepG2細胞的IC50為(2.08±0.33)μg/mL，對耐藥細胞HepG2/ADM的IC50為(14.18±1.61)μg/mL，HepG2/ADM細胞對阿霉素的耐藥指數(shù)為6.81，呈中度耐藥。作用于HepG2/ADM細胞48 h后，姜黃素(5 μg/mL)聯(lián)合阿霉素組、阿霉素組IC50分別為(9.50±1.12)μg/mL、(14.14±1.86)μg/mL，姜黃素的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.49。

2.3 4組HepG2/ADM細胞磷酸化p38MAPK蛋白的表達情況 其他3組HepG2/ADM細胞磷酸化p38MAPK蛋白的相對表達水平均低于對照組(均P<0.05)；阿霉素與姜黃素聯(lián)合組HepG2/ADM細胞磷酸化p38MAPK蛋白的相對表達水平均低于姜黃素組、阿霉素組(均P<0.05)，但姜黃素組與阿霉素組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2及圖1。

表2 4組HepG2/ADM細胞磷酸化p38MAPK蛋白的表達情況(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與阿霉素與姜黃素聯(lián)合組比較，#P<0.05。

圖1 4組HepG2/ADM細胞磷酸化p38MAPK蛋白的表達情況

注：1、2、3、4分別代表對照組、阿霉素組、姜黃素組、阿霉素與姜黃素聯(lián)合組。

3 討 論

原發(fā)性肝癌是世界五大癌癥之一，在癌癥相關(guān)死亡率中位居第二[1]。經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)是中晚期患者首選的治療方式，常用的藥物有細胞毒類藥物阿霉素、鉑類藥物卡鉑以及抗代謝類藥物氟尿嘧啶等，但容易出現(xiàn)化療耐藥。而細胞對化療藥耐藥是導致治療失敗的主要原因之一，因此，尋找提高腫瘤細胞對化療藥敏感性的藥物具有重要意義。

姜黃素是一種多酚類化合物，多項研究顯示姜黃素可逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對化療藥的耐藥性[8,12]。本實驗結(jié)果顯示，姜黃素可抑制肝癌耐藥細胞HepG2/ADM的增殖，且在一定作用時間、作用濃度范圍內(nèi)具有濃度、時間依賴性；此外，姜黃素對耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.49，提示其可一定程度上逆轉(zhuǎn)耐藥細胞對阿霉素的耐藥性。但姜黃素可逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對化療藥耐藥性的具體作用機制尚未明確。魏蔚等[13]分現(xiàn)，姜黃素可逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥細胞Bel7402/ADR對阿霉素的耐藥性，且其可能是通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路而增強阿霉素誘導的細胞凋亡起作用。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶相關(guān)信號通路，有研究表明其與腫瘤細胞的化療耐藥密切相關(guān)。周業(yè)庭等[14]研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK在人肝癌組織中的表達高于早期癌組織和正常黏膜組織，且其在肝癌組織中的表達與P-糖蛋白表達呈正相關(guān)，基于P-糖蛋白與化療耐藥的相關(guān)性，提示p38MAPK的高表達與化療耐藥相關(guān)。唐鵬等[10]通過順鉑誘導HepG2細胞耐藥，發(fā)現(xiàn)隨著誘導時間的延長，磷酸化p38MAPK表達逐漸升高，這提示p38MAPK磷酸化在肝癌化療耐藥中起一定的作用。為進一步探討姜黃素逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥細胞HepG2/ADM耐藥的機制是否與p38MAPK信號通路相關(guān)，本研究進一步檢測HepG2/ADM細胞的磷酸化p38MAPK蛋白的表達，結(jié)果顯示，姜黃素組、姜黃素聯(lián)合阿霉素組細胞磷酸化p38MAPK蛋白相對表達水平均低于對照組，且姜黃素聯(lián)合阿霉素組的表達水平均低于姜黃素組、阿霉素組(均P<0.05)，即姜黃素不僅可抑制磷酸化p38MAPK蛋白表達，且與阿霉素聯(lián)合應用對磷酸化p38MAPK表達的抑制作用更強，這提示姜黃素逆轉(zhuǎn)肝癌細胞HepG2/ADM對阿霉素的耐藥性可能與p38MAPK信號通路有關(guān)。

綜上所述，姜黃素不僅可體外抑制肝癌耐藥細胞HepG2/ADM的增殖，同時可在一定程度上逆轉(zhuǎn)其對阿霉素的耐藥性，其機制可能與抑制p38MAPK的磷酸化有關(guān)。但由于本實驗為細胞實驗，且只檢測磷酸化p38MAPK的表達，存在一定的局限性，后續(xù)可對其他p38MAPK相關(guān)通路進行進一步研究。