何法霖， 林 博， 王 薇， 鐘 堃， 袁 帥， 杜雨軒， 王治國

（1.北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學(xué)中心 衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心/北京市臨床檢驗工程技術(shù)研究中心，北京 100730；2.浙江大學(xué)計算機科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310013）

先天代謝異常又稱遺傳代謝病，是指由于基因突變引起酶活性下降、細胞膜功能異?；蚴荏w缺陷導(dǎo)致機體生化代謝紊亂，造成反應(yīng)底物、中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積，或終末代謝產(chǎn)物缺乏，引起一系列臨床癥狀的一組特殊的疾病[1-2]。遺傳代謝病發(fā)病機制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣且缺乏特異性，診斷主要依賴對患兒血、尿及其他體液中特異性代謝物質(zhì)的實驗室檢測。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)1次可檢測40多種指標，篩查數(shù)十種氨基酸、有機酸和脂肪酸氧化代謝病，越來越多的遺傳代謝病被診斷[3]。除開展室內(nèi)質(zhì)量控制和參加室間質(zhì)量評價（external quality assessment，EQA）之外，保證篩查質(zhì)量另一重要環(huán)節(jié)是篩查指標切值的設(shè)置，不恰當?shù)那兄禃档秃Y查效率、浪費醫(yī)療資源，并增加患者精神負擔[4]。國家衛(wèi)生部臨床檢驗中心針對亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、游離肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、辛酰肉堿、癸酰肉堿、十四烷酰希酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿、3-羥基-十六碳酰肉堿和3-羥基-異戊酰肉堿共16項指標切值的現(xiàn)狀進行調(diào)查分析，旨在為遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜切值的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2018年參加國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查氨基酸和?；鈮AEQA計劃的實驗室共151家，包括新生兒篩查中心、婦幼保健院及第三方檢測公司，涵蓋全國31個省自治區(qū)、直轄市。

1.2 研究方法

收集151家實驗室EQA計劃相關(guān)信息，包括：實驗室編碼、單位名稱、所在地區(qū)、指標切值、切值來源、方法學(xué)原理、儀器、試劑盒校準品及是否修改過切值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理分析，經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗顯示各組切值呈非正態(tài)分布。對16項指標的切值分布情況進行描述，包括中位數(shù)、最小值、最大值、百分位數(shù)。根據(jù)方法學(xué)原理對切值進行分析，并用秩和檢驗比較不同方法的組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查氨基酸和?；鈮A16項指標切值來源分析

151家實驗室中，上報有效數(shù)據(jù)的實驗室為114家，16項指標的切值來源所占比例基本相同。有80家（70.18%）實驗室切值來源為試劑廠家說明書；除苯丙氨酸項目外，有18家（15.79%）實驗室切值位自行確定，有16家（14.04%）實驗室切值來源于文獻報道；苯丙氨酸項目有19家（16.67%）實驗室切值為自行確定，有15家（13.16%）實驗室切值來源于文獻報道。49.12%～53.51%的實驗室修改過切值。見表1。

表1 114家臨床實驗室16項指標切值修改情況

2.2 新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查氨基酸和?；鈮A16項指標切值描述分析結(jié)果

使用串聯(lián)質(zhì)譜篩查氨基酸和?；鈮A16項指標按檢測方法分為衍生化檢測（24家）、非衍生化檢測（90家），按不同方法分組進行切值分析。其中瓜氨酸、游離肉堿分為2個切值，游離肉堿低值預(yù)示原發(fā)性系統(tǒng)肉堿缺乏癥，游離肉堿高值預(yù)示肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I缺乏癥；瓜氨酸低值預(yù)示鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏、N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥和氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥，瓜氨酸高值預(yù)示瓜氨血癥I型、精氨酰琥珀酸尿癥及希特林蛋白缺乏癥。結(jié)果顯示，16項指標不同檢測方法切值差異顯著（P＜0.05）。同一種檢測方法實驗室的切值也存在差異，采用衍生法檢測的實驗室間切值變異系數(shù)為25.26%～172.05%，采用非衍生法檢測的實驗室間切值變異系數(shù)為18.15%～200.92%，其中苯丙氨酸衍生法和非衍生法實驗室間的變異系數(shù)最小，3-羥基-十六碳酰肉堿衍生法和非衍生法實驗室間的變異系數(shù)最大，除瓜氨酸高值、亮氨酸、十四烷酰希酰肉堿和3-羥基-十六碳酰肉堿外，其他各項指標切值衍生法變異系數(shù)均大于非衍生法變異系數(shù)。見表2。

表2 串聯(lián)質(zhì)譜不同方法切值的統(tǒng)計結(jié)果

2.3 不同篩查方法切值離散程度

根據(jù)篩查實驗室所用實驗方法以及開展串聯(lián)質(zhì)譜以來是否修改過切值，繪制復(fù)合箱線圖。結(jié)果顯示，衍生法未修改切值的離散程度比修改過切值的離散程度更大。非衍生法除瓜氨酸低值外，其他指標未修改切值數(shù)據(jù)組與修改切值數(shù)據(jù)組離散程度相當，而瓜氨酸低值未修改過切值的數(shù)據(jù)比修改切值的數(shù)據(jù)離散程度大。見圖1。

圖1 16項指標按不同分類統(tǒng)計分析圖

3 討論

本研究涉及28個省市的141家開展串聯(lián)質(zhì)譜新生兒遺傳代謝病篩查項目的臨床實驗室，能較全面地反映我國串聯(lián)質(zhì)譜新生兒遺傳代謝病篩查切值設(shè)置現(xiàn)狀。從切值來源看，大部分實驗室選擇了試劑廠家說明書，14%的實驗室由自己確定，約50%的實驗室從未修改過切值。從篩查的方法看，78%（90/114）的實驗室使用非衍生法進行篩查，且使用非衍生法進行篩查的實驗室切值主要來源于試劑廠家說明書，而使用衍生法的24家實驗室切值主要由實驗室自己確定或來源于參考文獻。從切值百分位數(shù)分布結(jié)果看，第25位百分數(shù)與第75位百分數(shù)接近，但部分項目實驗室間差異較大。

氨基酸和?；鈮A的切值是用于評價新生兒是否患有遺傳代謝病的指標，而不恰當?shù)那兄悼赡軐?dǎo)致假陰性或者假陽性，造成臨床判讀的偏差，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2017年EQA計劃臨床判斷值的調(diào)查結(jié)果顯示，實驗室的臨床判斷值出現(xiàn)較大差異，35%的實驗室氨基酸和?；鈮A臨床判斷值與預(yù)期結(jié)果不一致。分析原因發(fā)現(xiàn)，除其中32%的實驗室檢測濃度存在系統(tǒng)誤差外，68%的實驗室是由于切值設(shè)置不合理造成的。根據(jù)美國臨床生物化學(xué)研究院實驗室操作指南建議的串聯(lián)質(zhì)譜新生兒遺傳代謝病篩查實驗室應(yīng)篩選幾百份甚至上千份正常新生兒樣本，且篩選樣本新生兒的年齡應(yīng)與實驗室實際篩查年齡一致，通過計算檢測結(jié)果的P1、P10、P99、P99位數(shù)，初步確定切值，高值為P99位數(shù)，低值為P10，再用1 000份新生兒樣本進行驗證，當陽性病例累積到一定數(shù)量時，高值可以選擇正常結(jié)果的99%位數(shù)到陽性結(jié)果的5%位數(shù)區(qū)間，低值可以選擇陽性結(jié)果的P99到正常結(jié)果的P1區(qū)間，實驗室確定切值需定期調(diào)整并驗證[5]。當然，切值設(shè)定的合理性還與室內(nèi)質(zhì)量控制息息相關(guān)，一般氨基酸類檢測項目變異系數(shù)在10%以內(nèi)，肉堿類檢測項目變異系數(shù)在40%以內(nèi)，只有穩(wěn)定的檢測結(jié)果切值才具有臨床意義。

串聯(lián)質(zhì)譜新生兒遺傳代謝病篩查不同于其他生化檢測，可1次檢測出數(shù)十種氨基酸及?；鈮A，計算時再加入幾十個氨基酸或?；鈮A之間的比值，最終由計算機軟件得出的結(jié)果可達100余項，并且1個指標可指向多種疾病，多個指標也可指向1種疾病，這就需要根據(jù)不同疾病的發(fā)病機制所導(dǎo)致的血中特異性氨基酸或酰基肉堿的異常進行分析，規(guī)則和切值設(shè)定，一直是困擾臨床的難點[5-6]。同時，串聯(lián)質(zhì)譜檢測多種氨基酸和?；鈮A的影響因素較多，如血斑的基質(zhì)效應(yīng)、內(nèi)標物的穩(wěn)定性、樣本的前處理過程等。此外，我國篩查實驗室區(qū)域性發(fā)展不平衡，浙江、上海、北京、廣州地區(qū)新生兒篩查中心串聯(lián)質(zhì)譜篩查量大（＞3萬），其中浙江省兒童醫(yī)院年篩查量達40萬，而更多的實驗室才剛剛起步，年串聯(lián)質(zhì)譜篩查量不足1萬[3]。另外，除苯丙酮尿癥外，其他遺傳代謝病發(fā)病率低，導(dǎo)致不少實驗室因陽性樣本不足而切值設(shè)置不合理。2005年，美國梅奧診所開發(fā)了美國區(qū)域性串聯(lián)質(zhì)譜新生兒疾病篩查實驗室質(zhì)量改進項目（Region 4 Stork，R4S），迄今為止已發(fā)展成為包含67個國家270個項目組的合作項目。R4S系統(tǒng)作為大樣本數(shù)據(jù)平臺，提供多種分析工具用于77種遺傳代謝病的篩查和診斷，該系統(tǒng)可以優(yōu)化臨床特異性指標，評估現(xiàn)用切值，幫助實驗室提高陽性預(yù)測值[7]。浙江省兒童醫(yī)院回顧性分析了實驗室30多萬個篩查數(shù)據(jù)，并通過參與R4S計劃評估實驗室切值，從而提高了實驗室的陽性預(yù)測值。而美國R4S新生兒篩查數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)大都來源于非亞洲國家，是否完全適合我國新生兒篩查，能否作為金標準，是需要探討的問題。

總之，目前我國新生兒遺傳代謝病篩查串聯(lián)質(zhì)譜切值差異較大，需要實驗室進行評估和驗證。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心將在國家重點專項基金的支持下聯(lián)合全國新生兒篩查中心及浙江大學(xué)計算機科學(xué)與技術(shù)學(xué)院開發(fā)中國新生兒遺傳代謝病篩查串聯(lián)質(zhì)譜切值評價平臺，進一步有效評價新篩實驗室切值。