金 姝， 朱 琪， 朱 元， 袁 亞， 蔡驍垚， 張 驥， 閆佩毅

（1.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，上海 200060；2.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院外科，上海 200060；3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院病理科，上海 200060；4.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院中心實驗室，上海 200060）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]。人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）定位于染色體17q21，編碼相對分子質(zhì)量為185 000的跨膜蛋白，是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族的成員，具有細胞內(nèi)酪氨酸激酶樣活性，通過不同的信號傳導通路，最終導致細胞無序增殖和惡性轉(zhuǎn)化。HER2的高表達發(fā)生在乳腺癌、胃癌、卵巢癌和肺癌中[2]，與腫瘤侵襲性生長和患者較差的預后相關。HER2的高表達與HER2基因擴增有關，然而在10%～20% HER2高表達的乳腺癌、胃癌和絕大部分HER2陽性的肺癌患者[3]中，HER2的高表達發(fā)生在沒有增加基因拷貝數(shù)的情況下，提示HER2轉(zhuǎn)錄失調(diào)可能是HER2高表達的機制之一，其中表觀遺傳學機制，如啟動子高甲基化可阻礙基因轉(zhuǎn)錄。盡管HER2高表達與患者預后不良有關，但對HER2基因啟動子甲基化和HER2基因表達機制的研究甚少。金姝等[4]采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）研究發(fā)現(xiàn)，HER2陽性乳腺癌組織HER2基因啟動子CpG島非甲基化率高于HER2陰性乳腺癌組織[4]，但該方法為定性研究，大量信息未能被發(fā)掘。因此，本研究采用焦磷酸測序方法，定量檢測HER2基因啟動子CpG島甲基化率，并比較癌組織與癌旁組織甲基化率和HER2 mRNA表達的差異，分析HER2基因啟動子CpG島甲基化水平與HER2基因活化機制的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2009年1月—2010年12月于上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的乳腺癌患者50例，均為女性，年齡35～89歲，臨床資料完整。按美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM分期標準（第6版）將50例乳腺癌患者分為0期5例、Ⅰ期14例、Ⅱ期25例、Ⅲ期6例。術(shù)后立即取癌組織樣本和癌旁組織[距離腫瘤邊緣＞1～＜2 cm處、肉眼觀察示外觀正常，避開壞死、炎癥部位，切片顯示乳腺組織占比＞40%，經(jīng)病理檢查確認）樣本置液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器

Gene Quant Ⅱ型RNA/DNA計算器（瑞典Pharmacia Biotech公司），Neofuge 15R型高速冷凍離心機[力新儀器（上海）有限公司]，S1000 thermal cycler PCR擴增儀（美國Termo Fisher公司），Tanon 1600R凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），LightCycler480熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）。2 mmol/L each dNTP Mix、Taq DNA Polymeraser、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Fermentas公司。瓊脂糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司。SYBR Premix Ex Taq購自日本TAKARA公司。TRIzol Reagent購自美國Invitrogen公司。FlexiGene DNA Kit和QIAGEN EpiTect Bisulfite購自美國QIAGEN公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA抽提 采用FlexiGene DNA Kit抽提基因組DNA，嚴格按說明書操作。

1.3.2 甲基化修飾 采用QIAGEN EpiTect Bisulfite進行甲基化修飾，嚴格按說明書操作。

1.3.3 甲基化修飾后的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaciton，PCR）HER2基因有不同的轉(zhuǎn)錄子，在genecard上可以查到2個啟動子序列，長度分別為929和1 100 bp。本研究分別為2個啟動子序列各設計了一套引物，根據(jù)引物的分值選擇第2個啟動子序列作為靶序列，由深圳華大基因科技有限公司合成引物。引物序列見表1。反應體系：總體積50 μL，上、下游引物（50 pmo/μL）各1 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，模版2 μL，Taq（5 U/μL）0.2 μL，5×buffer 10 μL，用去離子水補足體積。反應條件：預變性95 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火51 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

表1 甲基化修飾后的PCR和焦磷酸測序引物序列

1.3.4 焦磷酸測序 測序引物起始位點位于1 100 bp啟動子的694 bp處。序列見表1中的S1引物。分析的6個甲基化位點位于720～757 bp處，長度為38 bp，見圖1。測序由晶能生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.3.5 RNA提取 采用TRIzol Reagent提取RNA，按試劑盒說明書進行操作。測定RNA濃度后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 HER2基因1 100 bp的啟動子中720 bp～757 bp的6個甲基化位點

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄反應 采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA），嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.7 實時熒光定量PCR 按SYBR Premix Ex Taq說明書進行操作。引物序列見表2。HER2 mRNA的相對表達量用2-ΔCt值表示，其中ΔCt=Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因。反應體系：總體積25 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，模版2 μL，SYBR Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，去離子水8.5 μL。反應條件：預變性95 ℃ 10 s；變性95℃5 s，退火及延伸60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.3.8 免疫組化法測定HER2蛋白表達 石蠟包埋組織切片經(jīng)脫蠟、脫水后，滴加兔抗人HER2蛋白一抗，4 ℃過夜。磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌，滴加羊抗兔二抗，37 ℃溫育30 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。鏡下見棕黃色顆粒后終止反應。蘇木精復染。純乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。膜染色根據(jù)Hercep Test評分系統(tǒng)判斷：“-”為完全沒有著色或有＜10%的腫瘤細胞有細胞膜著色，“+”為有＞10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)微弱不完整的細胞膜著色，“++”為有＞10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)弱至中度完整的細胞膜著色，“+++”為有＞10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)強且完整的細胞膜著色；“-”和“+”視為陰性，“++”和“+++”視為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中HER2基因啟動子CpG島甲基化率和HER2 mRNA的表達

50例乳腺癌患者的癌組織樣本中HER2陽性17例，陽性率為34%，其中11例++、6例+++；陰性33例，其中21例-、12例+。HER2陽性癌組織HER2 mRNA相對表達量顯著高于HER2陰性癌組織（P＜0.05）。HER2陽性癌組織中HER2基因啟動子6個甲基化位點的甲基化率稍低于HER2陰性癌組織，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 HER2陽性和陰性癌組織之間HER2 mRNA和HER2基因啟動子CpG島甲基化率的比較

2.2 HER2陽性癌組織和癌旁組織HER2基因啟動子CpG島甲基化率和HER2 mRNA表達的比較

HER2陽性癌組織HER2 mRNA相對表達量與對應的癌旁組織比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在6個甲基化位點中，除第6個位點外，其他位點的甲基化率癌組織與對應的癌旁組織之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 HER2陽性癌組織與對應的癌旁組織之間HER2 mRNA相對表達量和HER2基因啟動子CpG島甲基化率比較

2.3 HER2陰性癌組織與對應的癌旁組織之間HER2基因啟動子CpG島甲基化率、HER2 mRNA相對表達量的比較

HER2陰性癌組織HER2 mRNA相對表達量顯著低于對應的癌旁組織（P＜0.05），而6個甲基化位點的甲基化率均高于對應的癌旁組織（P＜0.05）。見表5。

2.4 HER2陽性與陰性癌旁組織之間HER2基因啟動子CpG島甲基化率和HER2 mRNA相對表達量的比較

HER2陽性癌旁組織HER2 mRNA相對表達量及HER2基因啟動子CpG島甲基化率與HER2陰性癌旁組織比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表6。

表5 HER2陰性癌組織與對應的癌旁組織之間HER2 mRNA相對表達量和HER2基因啟動子CpG島甲基化率的比較

表6 HER2陽性與陰性癌旁組織之間HER2 mRNA相對表達量和HER2基因啟動子CpG島甲基化率的比較

3 討論

乳腺癌是一種在分子、細胞、臨床結(jié)局方面有高度異質(zhì)性的疾病[5]。根據(jù)乳腺癌患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和HER2表達模式可分為4種臨床型別：ER+、ER+/HER2-、HER2+和Triple-negative?；谛酒夹g(shù)的基因表達分析可將乳腺癌分為4種mRNA亞型：luminal A型、luminal B型、HER2-enriched（HER2-E）型和Basal-like型。其中臨床分型為HER2+的乳腺癌至少可以分為2種mRNA亞型：HER2-E亞型（約占50%，HER2 mRNA高表達，預后較差）和luminal亞型（HER2 mRNA低表達，預后較好）[6]，HER2-E mRNA亞型的一個重要特點是HER2 mRNA高表達，不同mRNA亞型的患者無瘤生存期有顯著差異[7]。由此可見，乳腺癌的臨床分型與mRNA亞型不一致，其中一個現(xiàn)象即為HER2 mRNA與HER2蛋白表達不一致。只有當HER2蛋白和HER2 mRNA表達一致時，腫瘤才顯示較強的受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）信號，這提示HER2 mRNA水平比HER2蛋白水平更能代表生長因子受體家族信號通路的激活。有研究結(jié)果顯示，乳腺癌中HER2 mRNA與HER2蛋白表達不一致，約有50%以上的HER2蛋白陽性癌組織中HER2 mRNA呈低表達[8-9]，這種不一致的情況可能會影響臨床腫瘤科醫(yī)生對靶向治療和新輔助化療的決策[10]。本研究結(jié)果顯示，HER2陽性癌組織和癌旁組織的HER2 mRNA表達較高，同時HER2陰性的癌旁組織HER2 mRNA也呈高表達，提示即使HER2蛋白低表達的癌旁組織仍有HER2下游信號通路被激活的可能。

乳腺癌的病理組織學表現(xiàn)為導管過度增生，繼而發(fā)展為原位癌和浸潤癌，最后發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病。目前的癌癥發(fā)展理論表明，表觀遺傳修飾是腫瘤發(fā)生的早期事件[11]。但HER2基因的甲基化和mRNA表達在乳腺癌發(fā)生中的作用尚不清楚[12]。

GUY等[13]在小鼠乳腺腫瘤病毒（mouse mammary tumor virus，MMTV）啟動子/增強子的轉(zhuǎn)錄控制下建立攜帶HER2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，以評估HER2原癌基因在乳腺癌組織和癌旁組織中的特異性表達，結(jié)果顯示，有70%（16/23）的小鼠癌組織HER2 mRNA的表達水平高于癌旁組織（P＜0.05），剩余30%（7/23）的小鼠癌組織HER2 mRNA表達水平與癌旁組織相當（P＞0.05），但癌組織中的HER2蛋白水平高于癌旁組織（P＜0.05）。盡管HER2的過表達與人原發(fā)性乳腺癌的基因擴增有關，但該轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤并沒有顯示出HER2基因擴增的證據(jù)。這表明除基因擴增外還有其他機制可導致HER2轉(zhuǎn)錄的增加及蛋白表達增加，同時癌旁組織也可出現(xiàn)HER2 mRNA高表達。ZHOU等[14]的研究結(jié)果支持GUY等[13]得出的MMTV/HER2轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺腫瘤中HER2過表達與MMTV啟動子低甲基化有關的結(jié)論。這些轉(zhuǎn)基因小鼠的正常乳腺始終含有MMTV啟動子的特定甲基化區(qū)域。金姝等[4]的研究結(jié)果提示，乳腺癌組織HER2基因啟動子低甲基化與HER2蛋白高表達有關。由此可見，MMTV啟動子從甲基化到低甲基化的轉(zhuǎn)變可誘導HER2蛋白的高水平表達，這是一個乳腺上皮生長惡性轉(zhuǎn)化的早期事件。FREUDENBERG等[15]的研究結(jié)果顯示，HER2蛋白的過表達發(fā)生在從乳腺增生到乳腺導管原位癌的轉(zhuǎn)變過程中，貫穿整個腫瘤的發(fā)展過程。一般來說，表觀遺傳修飾的程度隨著疾病的進展而累積，而原發(fā)性腫瘤可能作為一個中心，甲基化密度從中心逐漸向外擴散到周圍組織。YAN等[16]的研究結(jié)果顯示，乳腺中存在從原發(fā)腫瘤向外延伸4 cm這一區(qū)域的表觀遺傳變化。POLYAK等[17]的研究結(jié)果也顯示，不僅惡性細胞本身會出現(xiàn)甲基化缺陷，周圍組織也會表現(xiàn)出甲基化缺陷。乳腺癌的“區(qū)域癌變”理論提示腫瘤周圍正常的組織會出現(xiàn)致瘤性的修飾[18]。因此，癌組織周圍的“正?！比橄俳M織很有可能存在癌前細胞。

近年來，關于乳腺癌HER2基因啟動子甲基化的研究報道較少。一般認為HER2蛋白的表達與諸多其他基因的甲基化狀態(tài)有關，如多種基質(zhì)金屬蛋白酶啟動子的非甲基化狀態(tài)與HER2低表達有關[19]，或者HER2內(nèi)含子中有增強子，能增強HER2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性[20]。但很少有研究闡述HER2基因本身的甲基化狀態(tài)。LINDQVIST等[21]對HER2陽性乳腺癌的全基因組甲基化進行了研究，結(jié)果顯示，與正常組織比較，HER2陽性的乳腺癌組織中HER2基因啟動子呈低甲基化，他們指出HER2陽性乳腺癌組織HER2基因甲基化狀態(tài)的改變尚未見相關報道，但他們未對HER2陰性的乳腺癌組織和癌旁組織進行研究。

本研究研究結(jié)果顯示，HER2陽性乳腺癌組織的HER2 mRNA相對表達量和HER2基因啟動子CpG島甲基化率與癌旁組織比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；HER2陰性乳腺癌組織HER2 mRNA相對表達量顯著低于癌旁組織，甲基化率顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。這提示，在HER2陰性的乳腺癌組織中，HER2基因啟動子甲基化率升高可能是HER2 mRNA低表達的機制之一。本研究結(jié)果還顯示，癌旁組織中HER2 mRNA呈高表達，提示這些組織受到了累及，但未完全轉(zhuǎn)化，腫瘤組織周圍外觀正常的癌旁組織已出現(xiàn)了表觀遺傳學改變的早期事件。另外，HER2陽性癌組織HER2 mRNA表達水平顯著高于HER2陰性癌組織（P＜0.05），而甲基化率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但HER2陽性乳腺癌組織甲基化率呈降低趨勢，與LINDQVIST等[21]的研究結(jié)果一致。值得注意的是，本研究結(jié)果顯示，癌旁組織HER2啟動子低甲基化與HER2 mRNA高表達同時發(fā)生，但與HER2蛋白表達無關，因此癌旁組織HER2蛋白的表達可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，抑制HER2蛋白的表達。

綜上所述，在HER2陰性的乳腺癌組織中，HER2基因啟動子CpG島高甲基化及HER2 mRNA低表達，癌旁組織的HER2基因啟動子CpG島低甲基化與HER2 mRNA高表達同時存在，揭示了HER2基因甲基化與其表達的關系，為HER2在乳腺癌中的作用機制研究提供了實驗和理論基礎。另外，癌旁組織異常表達HER2 mRNA，是否可預示其下游RTK途徑的激活還有待進一步研究。