周碧燕， 趙麗萍， 陶文富， 方靈燕， 李少芳， 張可可， 何亞妮， 韋榮國(guó)

（南寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530022）

由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染所致的乙型肝炎是最常見的病毒性肝炎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有1/3的人曾感染HBV，2015年慢性HBV感染者約為2.57億人，占全球人口的3.5%，每年約有88.7萬(wàn)人死于慢性HBV感染引起的肝硬化和肝細(xì)胞癌等相關(guān)疾病[1-2]。我國(guó)是目前世界上HBV感染人數(shù)最多的國(guó)家，1992年全國(guó)HBsAg攜帶者占總?cè)丝诘?.75%，2006年下降到7.18%[3]，在1～29歲人群中，HBsAg的患病率從1992年的10.1%下降到2014年的2.6%。盡管如此，我國(guó)仍有7 700～9 700萬(wàn)人患有慢性HBV感染，其中2 000～3 000萬(wàn)人患有活動(dòng)性肝病[4]。快速、及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物[乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙型肝炎e抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙型肝炎核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb）、乙型肝炎前S1抗原（pre S1 antigen，PreS1Ag）]對(duì)乙型肝炎的防治具有重要意義。為此，本研究參照中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和PreS1Ag的關(guān)鍵性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，并統(tǒng)計(jì)該檢測(cè)系統(tǒng)使用前后的樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間（turn-around time，TAT）。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集2019年2—3月南寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科完成檢測(cè)后剩余的臨床血清樣本，其中確診為乙型肝炎患者的血清樣本18份（患者男10例，女8例，年齡17～80歲）、體檢健康者血清樣本20份（男8名、女12名，年齡3～84歲）。

1.2 儀器與試劑

將Autolas B-1 Series免疫流水線分析系統(tǒng)（鄭州安圖生物工程股份有限公司，含4臺(tái)AutoLumo A2000Plus全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀、軌道系統(tǒng)、前處理系統(tǒng)和后處理系統(tǒng)）與配套試劑（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品組成檢測(cè)系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱免疫流水線），嚴(yán)格按本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。

1.3 檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證

1.3.1 精密度、線性范圍、可報(bào)告范圍、參考區(qū)間和檢出限的驗(yàn)證 參照WS/T 420—2013[5]、WS/T 492—2016[6]、WS/T 494—2017[7]、CNASGL037：2019[8]和CNAS-GL038：2019[9]規(guī)定的方法對(duì)精密度、線性范圍、可報(bào)告范圍、參考區(qū)間和檢出限進(jìn)行驗(yàn)證。采用磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)20名體檢健康者的血清樣本，將結(jié)果與廠商提供的參考區(qū)間進(jìn)行比較。如落在參考區(qū)間外的檢測(cè)結(jié)果不超過(guò)2個(gè)，則參考區(qū)間可直接使用，否則需重新建立參考區(qū)間。

1.3.2 樣本TAT 樣本TAT的計(jì)算參照MILER等[10]的方法。由于在使用免疫流水線前，當(dāng)天檢測(cè)的樣本送達(dá)時(shí)間截止至上午10：30，10：30后送達(dá)的樣本放第2天檢測(cè)，而使用免疫流水線后，該時(shí)間點(diǎn)延長(zhǎng)至下午15：00。因此，以當(dāng)天10：30和15：00為時(shí)間截點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)免疫流水線使用前后各1個(gè)月內(nèi)（2019年3月和2019年8月）每天8：00—10：30和8：00—15：00接收的檢測(cè)乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物的樣本在實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（laboratory information system，LIS）中從申請(qǐng)、接收、錄入、檢測(cè)到審核的時(shí)間，計(jì)算乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物的TAT。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。TAT以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]和90%百分位數(shù)（90%的樣本完成所需的時(shí)間）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度

磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）均低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的總不精密度（10%），批內(nèi)s（重復(fù)性不精密度）和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度的結(jié)果均低于重復(fù)性不精密度及總不精密度的驗(yàn)證值。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的精密度可接受。

2.2 線性范圍

根據(jù)廠商聲明的線性范圍，每個(gè)項(xiàng)目均收集高（H）、低（L）值血清樣本各1份，按L、4L+H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H混合，每份混合血清重復(fù)檢測(cè)2次，取均值。以稀釋度為橫坐標(biāo)，每個(gè)稀釋度的測(cè)定均值為縱坐標(biāo)作線性回歸圖。若實(shí)測(cè)值和理論值的偏差在實(shí)驗(yàn)室允許范圍（±5%）內(nèi)，則可直接判定測(cè)定方法在所涉及的濃度范圍內(nèi)呈線性。磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物的線性回歸方程分別為HBsAgY=0.942 7X-4.702 8（r2=0.993 8），HBsAbY=0.994 6X-8.823 1（r2=0.999 1），HBeAgY=1.007 9X-1.093 3（r2=0.996 9），HBeAbY=0.992 8X-0.059 9（r2=0.995 4），HBcAbY=1.008 5X-0.005 3（r2=0.998 0）和PreS1AgY=0.980 8X+1.088 0（r2=0.998 7）。見圖1。

2.3 臨床可報(bào)告范圍

每個(gè)項(xiàng)目選取接近線性高值的樣本各1份，按照2、4、8、16倍稀釋（理論濃度），重復(fù)檢測(cè)2次，計(jì)算均值（稀釋濃度）。計(jì)算稀釋回收率[稀釋回收率（%）=稀釋濃度/理論濃度×100%]，以稀釋回收率在95%～105%范圍內(nèi)作為可接受標(biāo)準(zhǔn)。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和PreS1Ag的臨床可報(bào)告范圍分別為0.01～400.00 IU/mL、0.57～1 948.90 mIU/mL、0.01～203.36 PEIU/mL、0.02～17.24 PEIU/mL、0.20～79.23 PEIU/mL和0.58～246.13 AU/mL，與廠商提供的臨床可報(bào)告范圍[0.01～200.00 IU/mL、0.57～974.45 mIU/mL、0.01～203.36 PEIU/mL、0.02～4.31 PEIU/mL、0.20～39.61 PEIU/mL、0.58～246.13 AU/mL]接近。

表1 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物的精密度

圖1 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物的線性回歸圖

2.4 參考區(qū)間

采用磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)20名體檢健康者的乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物，檢測(cè)結(jié)果均落在廠商提供的參考區(qū)間內(nèi)，參考區(qū)間驗(yàn)證通過(guò)。

2.5 檢出限（limit of detection，LOD）

選取5份與廠家聲明的LOD水平相等的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定4 d，共獲得至少20個(gè)結(jié)果，如有超過(guò)95%的樣本的檢測(cè)結(jié)果大于廠家聲明的空白限（limit of blank，LOB），檢出限驗(yàn)證通過(guò)。廠家聲明的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb的LOD分別為0.03 IU/mL、3 mIU/mL、0.04 PEIU/mL、0.04 PEIU/mL和0.4 PEIU/mL，LOB分別為0.01 IU/mL、2 mIU/mL、0.02 PEIU/mL、0.03 PEIU/mL和0.2 PEIU/mL。所有檢測(cè)結(jié)果均大于廠家聲明的LOB，所有項(xiàng)目驗(yàn)證通過(guò)。

2.6 樣本TAT

在使用免疫流水線后，雖然2019年8月的樣本量（3 113例）比2019年3月的樣本量（3 742例）增加了20%，但是8：00—10：30、8：00—15：00接收的和8：00—15：00接收但當(dāng)天未出報(bào)告的樣本從接收到審核和從錄入到審核的時(shí)間分別減少了35%、54%，42%、22%，8%、53%；90%樣本的完成時(shí)間分別減少了14%、34%、79%、37%，44%、14%。與使用免疫流水線前的TAT比較，使用免疫流水線后的TAT明顯縮短（P＜0.000 1）。見表2。

表2 免疫流水線使用前、后TAT的比較

3 討論

HBV血清學(xué)標(biāo)志物的檢驗(yàn)是輔助診斷乙型肝炎的主要方法。HBV抗原和抗體常見的檢測(cè)方法為化學(xué)發(fā)光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。2種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，ELISA操作便捷、成本較低，但易污染、靈敏度較低。CLIA較ELISA檢測(cè)重復(fù)性好，靈敏度高。對(duì)于病毒載量濃度較低或處于“窗口期”的獻(xiàn)血者，ELISA存在漏檢[11]，對(duì)于在免疫耐受期等患者的高值樣本，不同的CLIA檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)HBsAg定量檢測(cè)存在偏差。因此，臨床上用HBsAg進(jìn)行抗病毒治療監(jiān)測(cè)時(shí)應(yīng)選擇同一種檢測(cè)系統(tǒng)[12]。

目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道的性能驗(yàn)證研究大部分是基于美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)的相關(guān)文件（EP15-A2、EP6-A2、EP7-A2和C28-A2等）或美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正法規(guī)進(jìn)行方案設(shè)計(jì)，但有些性能指標(biāo)需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室要求或本地法規(guī)自行建立，有些性能指標(biāo)并無(wú)判斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究同時(shí)參照相關(guān)文件，綜合確定了驗(yàn)證方案，對(duì)磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物的各項(xiàng)性能指標(biāo)進(jìn)行了較為完整的評(píng)價(jià)。

本研究結(jié)果顯示，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物的批內(nèi)s、批間方差和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)s均符合要求，線性回歸的r2值＞0.995，均符合要求。檢測(cè)20名體檢健康者的乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物，檢測(cè)結(jié)果均落在廠商提供的參考區(qū)間內(nèi)，參考區(qū)間驗(yàn)證通過(guò)。采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)與廠家聲明的LOD水平相當(dāng)?shù)臉颖镜囊倚透窝?項(xiàng)血清標(biāo)志物，其檢測(cè)結(jié)果均大于廠家聲明的LOB，LOD驗(yàn)證通過(guò)。廠家聲明的HBsAg和HBsAb的LOD分別為0.03 IU/mL和3 mIU/mL，根據(jù)WS/T 494—2017的要求，用于診斷感染性疾病抗原和抗體的測(cè)定方法的最低檢出限越低越好，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBsAg和HBsAb的最低檢出限應(yīng)低于0.1 IU/mL和10 mIU/mL[7]，驗(yàn)證結(jié)果滿足WS/T 494—2017的要求。

TAT是指實(shí)驗(yàn)室從收到樣本到出具報(bào)告的時(shí)間（以min為單位）。本研究結(jié)果顯示，使用免疫流水線顯著提升了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)效率，TAT明顯縮短，有些項(xiàng)目甚至縮短了79%以上。本實(shí)驗(yàn)室在使用免疫流水線前，每次檢測(cè)乙型肝炎6項(xiàng)血清標(biāo)志物時(shí)需湊夠96人份才能上機(jī)檢測(cè)，操作繁瑣，而免疫流水線能做到樣本隨到隨測(cè)，操作簡(jiǎn)便，符合實(shí)驗(yàn)室的預(yù)期要求和工作要求。另外，由于免疫流水線可以隨時(shí)檢測(cè)樣本，因此本實(shí)驗(yàn)室把接收樣本的時(shí)間延長(zhǎng)至下午15：00點(diǎn)。另外，該免疫流水線能滿足2 h內(nèi)出報(bào)告和24 h急診的需求，因此可以滿足臨床個(gè)別科室將一些傳染病項(xiàng)目列為急診的要求，極大的方便了患者和臨床，降低了患者看病的時(shí)間成本。

綜上所述，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的關(guān)鍵性能指標(biāo)均符合臨床要求，使用免疫流水線可大幅縮短TAT，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。