吳思穎， 王曉慶， 劉山泉， 肖玉玲， 何 超， 馬 瑩， 謝 軼， 康 梅

（四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041）

近年來(lái)，腸球菌的耐藥率逐漸上升，尤其是耐萬(wàn)古霉素腸球菌（vancomycin-resistantEnterococcus，VRE）的出現(xiàn)，給臨床治療帶來(lái)很大負(fù)擔(dān)。在臨床感染和定植的VRE中，以耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌（vancomycin-resistantEnterococcus faecium，VREfm）最為常見(jiàn)[1-2]。目前，VRE的檢測(cè)主要依靠體外藥物敏感性試驗(yàn)，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)，缺乏及時(shí)性。分子生物學(xué)方法檢測(cè)耐藥基因成本高且操作復(fù)雜。建立VRE的快速檢測(cè)方法，對(duì)指導(dǎo)臨床治療和控制細(xì)菌耐藥性傳播至關(guān)重要。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted 1aser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種新型的軟電離分析技術(shù)，不同的細(xì)菌經(jīng)MALDI-TOF MS檢測(cè)可以形成特異性的指紋圖譜，將其與數(shù)據(jù)庫(kù)中的指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定病原菌，目前已被用于臨床實(shí)驗(yàn)室微生物的鑒定。除了用于鑒定病原菌，MALDI-TOF MS還被用來(lái)識(shí)別抗菌藥物耐藥性以及對(duì)菌株進(jìn)行分型，以確定流行病學(xué)相關(guān)性。如MALDI-TOF MS用于產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌的檢測(cè)和銅綠假單胞菌對(duì)黏菌素耐藥機(jī)制的研究，以及vanB陽(yáng)性屎腸球菌的流行病學(xué)分型[3-6]。本研究旨在評(píng)估MALDITOF MS快速鑒定vanA型耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌，及對(duì)VREfm進(jìn)行流行病學(xué)分型的能力。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集近2015年1月—2018年9月四川大學(xué)華西醫(yī)院66株VREfm臨床分離株及73株萬(wàn)古霉素敏感屎腸球菌（vancomycin-susceptibleEnterococcus faecium，VSEfm）臨床分離株。

1.2 儀器與試劑

MALDI-TOF MS儀（德國(guó)Bruker公司），VITEK-2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司），Veriti 96-Well PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；血瓊脂平板、MH瓊脂平板（鄭州安圖公司），萬(wàn)古霉素E-test（英國(guó)Oxoid公司），α-氰基-4-羥基肉桂酸（德國(guó)Bruker公司），無(wú)水乙醇（成都科龍公司），三氟乙酸（德國(guó)MERCK公司），乙腈（美國(guó)Tedia公司），甲酸（美國(guó)Anaqua Chemicals Supply公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及體外藥物敏感性試驗(yàn) 將待測(cè)菌株復(fù)蘇于血瓊脂平板，35 ℃孵育18～20 h。挑選血瓊脂平板上的可疑菌落經(jīng)VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)，對(duì)VITEK-2 Compact 鑒定為VREfm的菌株，經(jīng)萬(wàn)古霉素E-test 試驗(yàn)確證。

1.3.2 耐藥基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[7]擴(kuò)增萬(wàn)古霉素耐藥基因vanA、vanB、vanC1/vanC2。

1.3.3 MALDI-TOF MS鑒定 MALDI-TOF MS系統(tǒng)采用線性正性模式，采集相對(duì)分子質(zhì)量為2～2 000的圖譜。采用甲酸提取法，即取待測(cè)菌株，加入300 μL水和900 μL乙醇，混勻（此步驟用于滅活細(xì)菌）后加入30 μL 70%甲酸溶液，混勻后再加入30 μL乙腈混勻，離心，取1 μL上清在靶板上點(diǎn)樣，晾干后添加1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸，再晾干，應(yīng)用FlexControl和MALDI Biotyper 3.1軟件對(duì)139株菌株進(jìn)行鑒定。具體操作步驟按照儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 建立模型 保持基本參數(shù)不變，應(yīng)用ClinProTools 3.0軟件隨機(jī)比較45株VREfm和50株VSEfm，分析VREfm和VSEfm的差異蛋白質(zhì)譜峰。分別選用遺傳算法、監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法和快速分類算法建立相應(yīng)的模型。

1.3.5 外部驗(yàn)證 以剩下的21株VREfm和23株VSEfm為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用遺傳算法模型對(duì)其進(jìn)行分類，軟件可自動(dòng)判斷屎腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性，計(jì)算MALDI-TOF MS檢測(cè)VREfm的敏感性、特異性、陰性預(yù)測(cè)值和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。

1.3.6 多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 從66株VREfm中隨機(jī)挑選21株進(jìn)行MLST分析。擴(kuò)增屎腸球菌的7個(gè)管家基因（atpA、ddl、gdh、purK、gyd、pstS和adk），擴(kuò)增方法參見(jiàn)http：//efaecium.mlst.net/.。將測(cè)得的序列在線提交至E. faeciumMLST website（http：//efaecium.mlst.net/），得到21株VREfm的序列分型（sequence type，ST）型別。1.3.7 層次聚類分析 采用ClinProTools 3.0軟件對(duì)21株VREfm進(jìn)行層次聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 屎腸球菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

21株萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌中，有17株對(duì)萬(wàn)古霉素的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）＞256，有4株同時(shí)對(duì)利奈唑胺耐藥（MIC≥8）；21株均對(duì)替加環(huán)素敏感。73株萬(wàn)古霉素敏感屎腸球菌中，有65株對(duì)萬(wàn)古霉素的MIC≤0.5，有55株同時(shí)對(duì)環(huán)丙沙星、莫西殺星、左氧氟沙星、克林霉素和紅霉素耐藥；73株均對(duì)利奈唑胺和替加環(huán)素敏感。

2.2 萬(wàn)古霉素耐藥基因攜帶情況

66株VREfm均含有vanA基因，未發(fā)現(xiàn)vanB和vanC1/vanC2基因。

2.3 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

139株臨床分離株MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果均為屎腸球菌，66株VREfm的鑒定分值為2.321～2.521，73株VSEfm的鑒定分值為2.240～2.602。質(zhì)譜鑒定結(jié)果分值均＞2，表示可信度非常高，均能鑒定到種的水平。

2.4 ClinProTools 3.0軟件分析結(jié)果

2.4.1 質(zhì)譜圖統(tǒng)計(jì)分析 采用ClinProTools 3.0軟件進(jìn)行質(zhì)譜圖統(tǒng)計(jì)之后，將VREfm和VSEfm分成了比較明顯的2個(gè)區(qū)域，大多數(shù)菌株都落在相應(yīng)的VREfm或VSEfm分組中，見(jiàn)圖1。質(zhì)譜圖統(tǒng)計(jì)分析顯示，峰97、20、117、135和85是區(qū)分VREfm和VSEfm比較重要的差異質(zhì)譜峰，峰值統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。5個(gè)差異質(zhì)譜峰的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.951 972、0.925 177、0.910 01、0.883 215和0.898 888，表明這些峰在區(qū)分VREfm和VSEfm時(shí)具有較好的敏感性和特異性，見(jiàn)圖2。

圖1 VREfm和VSEfm的二維分布圖

表1 質(zhì)譜峰的峰值統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

2.4.2 3種算法建立模型結(jié)果 使用3種算法建立模型，遺傳算法和監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法具有相似的交叉驗(yàn)證能力（有效敏感性），分別為91.40%和90.89%，識(shí)別能力（等同于特異性）均為100%，快速分類算法的交叉驗(yàn)證能力和識(shí)別能力最低，分別為82.28%和84.56%。盡管差異不明顯，遺傳算法模型仍是區(qū)分VREfm和VSEfm最可靠的模型。

2.4.3 外部驗(yàn)證結(jié)果 采用遺傳算法建立的模型對(duì)21株VREfm和23株VSEfm進(jìn)行外部驗(yàn)證。遺傳算法的敏感性和特異性分別為95.2%（20/21）和95.7%（22/23）。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為95.2%（20/21）和95.7%（22/23）。

2.4.4 MLST和層次聚類分析結(jié)果 21株VREfm中有2株未查詢到ST型別，其余19株共有6種ST型別，包括ST78、 ST389、ST192、ST64、ST414和ST17。其中以ST78最常見(jiàn)，共12株，ST389和ST192各2株，ST64、ST414和ST17各1株。基于18的任意相似性截?cái)嘀?，?1株VREfm分為4個(gè)集群。集群1包含2種ST型別，分別為ST78和ST17；集群2只有1種ST型別，即ST414；集群3有2種ST型別，分別為ST78和ST389；集群4菌株數(shù)量最多（16株），其中大部分為ST78（10株），其他分別為2株ST192、1株ST64和1株ST389，2株未查詢到ST型別的菌株也被分到這個(gè)集群。見(jiàn)圖3。

圖2 質(zhì)譜峰ROC曲線

圖3 21株VREfm層次聚類分析

3 討論

目前常用的VRE篩選方法包括chromID VRE顯色培養(yǎng)基（法國(guó)生物梅里埃公司）、萬(wàn)古霉素藥物敏感性試驗(yàn)（VITEK-2、E-test法）以及PCR擴(kuò)增萬(wàn)古霉素耐藥基因。VRE顯色培養(yǎng)基主要用于肛拭子樣本篩選VRE攜帶者。藥物敏感性試驗(yàn)通常在收到樣本后第3或第4天報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果。分子生物學(xué)方法價(jià)格昂貴，暫未在臨床常規(guī)使用。MALDI-TOF MS因具有成本低、高效和快速的特點(diǎn)而被廣泛用于常規(guī)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室病原菌的鑒定。本研究應(yīng)用MALDITOF MS快速篩查vanA型VREfm，發(fā)現(xiàn)VREfm和VSRfm分成了比較明顯的2個(gè)區(qū)域，區(qū)分VREfm和VSEfm比較重要的5個(gè)差異質(zhì)譜峰的P值均＜0.000 001，且這5個(gè)峰的AUC均在0.9左右，進(jìn)一步說(shuō)明這5個(gè)峰在區(qū)分VREfm和VSEfm時(shí)具有較高的準(zhǔn)確性。使用3種算法建立模型對(duì)VREfm和VSEfm進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，遺傳算法是區(qū)分VREfm和VSEfm最可靠的模型。使用遺傳算法建立的模型進(jìn)行外部驗(yàn)證時(shí)，敏感性和特異性均為90%以上。吳薇等[8]對(duì)150株屎腸球菌的研究發(fā)現(xiàn)，使用遺傳算法建立模型進(jìn)行性能評(píng)估，MALDI-TOF MS篩查vanA型VREfm的敏感性和特異性分別為80%和90%，與本研究結(jié)果一致。有研究結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定vanB陽(yáng)性VREfm，在納入常規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作流程后，前瞻性驗(yàn)證結(jié)果顯示出較高的敏感性（96.7%）和特異性（98.1%）[3]。

培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)條件能影響生物標(biāo)記分子的出現(xiàn)，從而對(duì)質(zhì)譜峰產(chǎn)生影響[9]。因此，本研究嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間和溫度。采用直接涂布法直接挑取單個(gè)菌落涂抹到靶板上，自然晾干后在單菌落涂層上加入1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸，雖然簡(jiǎn)單快速，能夠用于大多數(shù)細(xì)菌的常規(guī)鑒定，但發(fā)現(xiàn)進(jìn)行MALDI-TOF MS分析時(shí)，使用直接涂布法對(duì)革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁肽聚糖的物理破壞并不能充分提取蛋白質(zhì)，且會(huì)因代謝物、色素和/或瓊脂干擾結(jié)晶過(guò)程而降低質(zhì)譜的分辨率[10-11]。甲酸提取法包括裂解細(xì)菌細(xì)胞，將蛋白質(zhì)釋放到提取物中，然后將其應(yīng)用于MALDI-TOF MS分析，克服了直接涂布法的缺點(diǎn)。陸文香等[12]發(fā)現(xiàn)，蛋白提取步驟獲取質(zhì)譜圖進(jìn)行外部驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，MALDI-TOF MS對(duì)VREfm和VSEfm菌株的鑒定正確率相對(duì)較高。

MALDI-TOF MS可應(yīng)用于碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌以及引起醫(yī)院暴發(fā)流行的弗勞地枸櫞酸桿菌和黏質(zhì)沙雷菌的分型，并且與MLST和全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）分型結(jié)果具有較好的一致性[13-14]。MALDI-TOF MS用于屎腸球菌菌株分型的研究結(jié)果各不相同。在GRIFFIN等[3]的研究中，當(dāng)使用2.5的相似性截?cái)嘀禃r(shí)，MALDI-TOF MS與脈沖場(chǎng)凝膠電泳的結(jié)果相似。而LASCH等[15]將MALDI-TOF MS與MLST分型結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，卻無(wú)法推斷出可靠的相關(guān)性。SCHLEBUSCH等[16]應(yīng)用MALDI-TOF MS對(duì)引起醫(yī)院暴發(fā)流行的VREfm進(jìn)行分析，并與WGS進(jìn)行了比較，MALDI-TOF MS分析顯示VREfm暴發(fā)分離株的蛋白質(zhì)組譜不完全相似，存在不同的集群，不是由單個(gè)菌株引起的暴發(fā)，使疫情的早期調(diào)查和管理得到了幫助，但如果需要更清楚地確定分離株之間的進(jìn)化關(guān)系，以確認(rèn)和進(jìn)一步調(diào)查疫情，則可以使用詳細(xì)基因組分析，如WGS。造成以上研究結(jié)果差異的原因可能是用于分析數(shù)據(jù)的軟件和模型不同。另外，MALDI-TOF MS易受技術(shù)和生物變異的影響，因?yàn)榻Y(jié)果是基于峰值強(qiáng)度，而峰值強(qiáng)度又與細(xì)菌基因表達(dá)和調(diào)控有內(nèi)在聯(lián)系。

本研究層次聚類分析結(jié)果顯示，絕大多數(shù)ST78的菌株被歸于同一集群，而和ST78歸于同一集群的還有ST192、ST389和ST64，2株未查詢到ST型別的菌株也被分到這個(gè)集群。ST78與ST192、ST64，ST17以及未查到的ST型別均只有1個(gè)等位基因的差異（single-locus variant，SLV），因此MALDI-TOF MS對(duì)于高度相關(guān)的ST型別，例如SLV，幾乎不能區(qū)分。FREITAS等[17]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用MALDI-TOF MS可區(qū)分屎腸球菌高風(fēng)險(xiǎn)克隆株（ST17、ST18和ST78等）和來(lái)自社區(qū)的克隆株（ST5、ST147和ST185）。本研究中的屎腸球菌均分離自醫(yī)院，均屬于CC17克隆復(fù)合體，即高風(fēng)險(xiǎn)克隆，后續(xù)需收集更多的菌株，特別是來(lái)自社區(qū)的分離株加以驗(yàn)證。