吳思穎， 王曉慶， 劉山泉， 肖玉玲， 何 超， 馬 瑩， 謝 軼， 康 梅

（四川大學華西醫(yī)院實驗醫(yī)學科，四川 成都 610041）

近年來，腸球菌的耐藥率逐漸上升，尤其是耐萬古霉素腸球菌（vancomycin-resistantEnterococcus，VRE）的出現(xiàn)，給臨床治療帶來很大負擔。在臨床感染和定植的VRE中，以耐萬古霉素屎腸球菌（vancomycin-resistantEnterococcus faecium，VREfm）最為常見[1-2]。目前，VRE的檢測主要依靠體外藥物敏感性試驗，但該方法耗時長，缺乏及時性。分子生物學方法檢測耐藥基因成本高且操作復雜。建立VRE的快速檢測方法，對指導臨床治療和控制細菌耐藥性傳播至關(guān)重要?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted 1aser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種新型的軟電離分析技術(shù)，不同的細菌經(jīng)MALDI-TOF MS檢測可以形成特異性的指紋圖譜，將其與數(shù)據(jù)庫中的指紋圖譜進行比對，從而鑒定病原菌，目前已被用于臨床實驗室微生物的鑒定。除了用于鑒定病原菌，MALDI-TOF MS還被用來識別抗菌藥物耐藥性以及對菌株進行分型，以確定流行病學相關(guān)性。如MALDI-TOF MS用于產(chǎn)碳青霉烯酶細菌的檢測和銅綠假單胞菌對黏菌素耐藥機制的研究，以及vanB陽性屎腸球菌的流行病學分型[3-6]。本研究旨在評估MALDITOF MS快速鑒定vanA型耐萬古霉素屎腸球菌，及對VREfm進行流行病學分型的能力。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集近2015年1月—2018年9月四川大學華西醫(yī)院66株VREfm臨床分離株及73株萬古霉素敏感屎腸球菌（vancomycin-susceptibleEnterococcus faecium，VSEfm）臨床分離株。

1.2 儀器與試劑

MALDI-TOF MS儀（德國Bruker公司），VITEK-2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司），Veriti 96-Well PCR擴增儀（美國ABI公司）；血瓊脂平板、MH瓊脂平板（鄭州安圖公司），萬古霉素E-test（英國Oxoid公司），α-氰基-4-羥基肉桂酸（德國Bruker公司），無水乙醇（成都科龍公司），三氟乙酸（德國MERCK公司），乙腈（美國Tedia公司），甲酸（美國Anaqua Chemicals Supply公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及體外藥物敏感性試驗 將待測菌株復蘇于血瓊脂平板，35 ℃孵育18～20 h。挑選血瓊脂平板上的可疑菌落經(jīng)VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行鑒定和體外藥物敏感性試驗，對VITEK-2 Compact 鑒定為VREfm的菌株，經(jīng)萬古霉素E-test 試驗確證。

1.3.2 耐藥基因檢測 參照文獻[7]擴增萬古霉素耐藥基因vanA、vanB、vanC1/vanC2。

1.3.3 MALDI-TOF MS鑒定 MALDI-TOF MS系統(tǒng)采用線性正性模式，采集相對分子質(zhì)量為2～2 000的圖譜。采用甲酸提取法，即取待測菌株，加入300 μL水和900 μL乙醇，混勻（此步驟用于滅活細菌）后加入30 μL 70%甲酸溶液，混勻后再加入30 μL乙腈混勻，離心，取1 μL上清在靶板上點樣，晾干后添加1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸，再晾干，應(yīng)用FlexControl和MALDI Biotyper 3.1軟件對139株菌株進行鑒定。具體操作步驟按照儀器說明書進行。

1.3.4 建立模型 保持基本參數(shù)不變，應(yīng)用ClinProTools 3.0軟件隨機比較45株VREfm和50株VSEfm，分析VREfm和VSEfm的差異蛋白質(zhì)譜峰。分別選用遺傳算法、監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法和快速分類算法建立相應(yīng)的模型。

1.3.5 外部驗證 以剩下的21株VREfm和23株VSEfm為實驗對象，利用遺傳算法模型對其進行分類，軟件可自動判斷屎腸球菌對萬古霉素的敏感性，計算MALDI-TOF MS檢測VREfm的敏感性、特異性、陰性預測值和陽性預測值。

1.3.6 多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 從66株VREfm中隨機挑選21株進行MLST分析。擴增屎腸球菌的7個管家基因（atpA、ddl、gdh、purK、gyd、pstS和adk），擴增方法參見http：//efaecium.mlst.net/.。將測得的序列在線提交至E. faeciumMLST website（http：//efaecium.mlst.net/），得到21株VREfm的序列分型（sequence type，ST）型別。1.3.7 層次聚類分析 采用ClinProTools 3.0軟件對21株VREfm進行層次聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 屎腸球菌藥物敏感性試驗結(jié)果

21株萬古霉素耐藥屎腸球菌中，有17株對萬古霉素的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）＞256，有4株同時對利奈唑胺耐藥（MIC≥8）；21株均對替加環(huán)素敏感。73株萬古霉素敏感屎腸球菌中，有65株對萬古霉素的MIC≤0.5，有55株同時對環(huán)丙沙星、莫西殺星、左氧氟沙星、克林霉素和紅霉素耐藥；73株均對利奈唑胺和替加環(huán)素敏感。

2.2 萬古霉素耐藥基因攜帶情況

66株VREfm均含有vanA基因，未發(fā)現(xiàn)vanB和vanC1/vanC2基因。

2.3 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

139株臨床分離株MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果均為屎腸球菌，66株VREfm的鑒定分值為2.321～2.521，73株VSEfm的鑒定分值為2.240～2.602。質(zhì)譜鑒定結(jié)果分值均＞2，表示可信度非常高，均能鑒定到種的水平。

2.4 ClinProTools 3.0軟件分析結(jié)果

2.4.1 質(zhì)譜圖統(tǒng)計分析 采用ClinProTools 3.0軟件進行質(zhì)譜圖統(tǒng)計之后，將VREfm和VSEfm分成了比較明顯的2個區(qū)域，大多數(shù)菌株都落在相應(yīng)的VREfm或VSEfm分組中，見圖1。質(zhì)譜圖統(tǒng)計分析顯示，峰97、20、117、135和85是區(qū)分VREfm和VSEfm比較重要的差異質(zhì)譜峰，峰值統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表1。5個差異質(zhì)譜峰的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.951 972、0.925 177、0.910 01、0.883 215和0.898 888，表明這些峰在區(qū)分VREfm和VSEfm時具有較好的敏感性和特異性，見圖2。

圖1 VREfm和VSEfm的二維分布圖

表1 質(zhì)譜峰的峰值統(tǒng)計數(shù)據(jù)

2.4.2 3種算法建立模型結(jié)果 使用3種算法建立模型，遺傳算法和監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法具有相似的交叉驗證能力（有效敏感性），分別為91.40%和90.89%，識別能力（等同于特異性）均為100%，快速分類算法的交叉驗證能力和識別能力最低，分別為82.28%和84.56%。盡管差異不明顯，遺傳算法模型仍是區(qū)分VREfm和VSEfm最可靠的模型。

2.4.3 外部驗證結(jié)果 采用遺傳算法建立的模型對21株VREfm和23株VSEfm進行外部驗證。遺傳算法的敏感性和特異性分別為95.2%（20/21）和95.7%（22/23）。陽性預測值和陰性預測值分別為95.2%（20/21）和95.7%（22/23）。

2.4.4 MLST和層次聚類分析結(jié)果 21株VREfm中有2株未查詢到ST型別，其余19株共有6種ST型別，包括ST78、 ST389、ST192、ST64、ST414和ST17。其中以ST78最常見，共12株，ST389和ST192各2株，ST64、ST414和ST17各1株?；?8的任意相似性截斷值，將21株VREfm分為4個集群。集群1包含2種ST型別，分別為ST78和ST17；集群2只有1種ST型別，即ST414；集群3有2種ST型別，分別為ST78和ST389；集群4菌株數(shù)量最多（16株），其中大部分為ST78（10株），其他分別為2株ST192、1株ST64和1株ST389，2株未查詢到ST型別的菌株也被分到這個集群。見圖3。

圖2 質(zhì)譜峰ROC曲線

圖3 21株VREfm層次聚類分析

3 討論

目前常用的VRE篩選方法包括chromID VRE顯色培養(yǎng)基（法國生物梅里埃公司）、萬古霉素藥物敏感性試驗（VITEK-2、E-test法）以及PCR擴增萬古霉素耐藥基因。VRE顯色培養(yǎng)基主要用于肛拭子樣本篩選VRE攜帶者。藥物敏感性試驗通常在收到樣本后第3或第4天報告陽性結(jié)果。分子生物學方法價格昂貴，暫未在臨床常規(guī)使用。MALDI-TOF MS因具有成本低、高效和快速的特點而被廣泛用于常規(guī)臨床微生物實驗室病原菌的鑒定。本研究應(yīng)用MALDITOF MS快速篩查vanA型VREfm，發(fā)現(xiàn)VREfm和VSRfm分成了比較明顯的2個區(qū)域，區(qū)分VREfm和VSEfm比較重要的5個差異質(zhì)譜峰的P值均＜0.000 001，且這5個峰的AUC均在0.9左右，進一步說明這5個峰在區(qū)分VREfm和VSEfm時具有較高的準確性。使用3種算法建立模型對VREfm和VSEfm進行分析時發(fā)現(xiàn)，遺傳算法是區(qū)分VREfm和VSEfm最可靠的模型。使用遺傳算法建立的模型進行外部驗證時，敏感性和特異性均為90%以上。吳薇等[8]對150株屎腸球菌的研究發(fā)現(xiàn)，使用遺傳算法建立模型進行性能評估，MALDI-TOF MS篩查vanA型VREfm的敏感性和特異性分別為80%和90%，與本研究結(jié)果一致。有研究結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS能夠快速、準確地鑒定vanB陽性VREfm，在納入常規(guī)實驗室工作流程后，前瞻性驗證結(jié)果顯示出較高的敏感性（96.7%）和特異性（98.1%）[3]。

培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)條件能影響生物標記分子的出現(xiàn)，從而對質(zhì)譜峰產(chǎn)生影響[9]。因此，本研究嚴格控制實驗條件，包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和溫度。采用直接涂布法直接挑取單個菌落涂抹到靶板上，自然晾干后在單菌落涂層上加入1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸，雖然簡單快速，能夠用于大多數(shù)細菌的常規(guī)鑒定，但發(fā)現(xiàn)進行MALDI-TOF MS分析時，使用直接涂布法對革蘭陽性菌細胞壁肽聚糖的物理破壞并不能充分提取蛋白質(zhì)，且會因代謝物、色素和/或瓊脂干擾結(jié)晶過程而降低質(zhì)譜的分辨率[10-11]。甲酸提取法包括裂解細菌細胞，將蛋白質(zhì)釋放到提取物中，然后將其應(yīng)用于MALDI-TOF MS分析，克服了直接涂布法的缺點。陸文香等[12]發(fā)現(xiàn)，蛋白提取步驟獲取質(zhì)譜圖進行外部驗證實驗時，MALDI-TOF MS對VREfm和VSEfm菌株的鑒定正確率相對較高。

MALDI-TOF MS可應(yīng)用于碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌以及引起醫(yī)院暴發(fā)流行的弗勞地枸櫞酸桿菌和黏質(zhì)沙雷菌的分型，并且與MLST和全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）分型結(jié)果具有較好的一致性[13-14]。MALDI-TOF MS用于屎腸球菌菌株分型的研究結(jié)果各不相同。在GRIFFIN等[3]的研究中，當使用2.5的相似性截斷值時，MALDI-TOF MS與脈沖場凝膠電泳的結(jié)果相似。而LASCH等[15]將MALDI-TOF MS與MLST分型結(jié)果進行比較時，卻無法推斷出可靠的相關(guān)性。SCHLEBUSCH等[16]應(yīng)用MALDI-TOF MS對引起醫(yī)院暴發(fā)流行的VREfm進行分析，并與WGS進行了比較，MALDI-TOF MS分析顯示VREfm暴發(fā)分離株的蛋白質(zhì)組譜不完全相似，存在不同的集群，不是由單個菌株引起的暴發(fā)，使疫情的早期調(diào)查和管理得到了幫助，但如果需要更清楚地確定分離株之間的進化關(guān)系，以確認和進一步調(diào)查疫情，則可以使用詳細基因組分析，如WGS。造成以上研究結(jié)果差異的原因可能是用于分析數(shù)據(jù)的軟件和模型不同。另外，MALDI-TOF MS易受技術(shù)和生物變異的影響，因為結(jié)果是基于峰值強度，而峰值強度又與細菌基因表達和調(diào)控有內(nèi)在聯(lián)系。

本研究層次聚類分析結(jié)果顯示，絕大多數(shù)ST78的菌株被歸于同一集群，而和ST78歸于同一集群的還有ST192、ST389和ST64，2株未查詢到ST型別的菌株也被分到這個集群。ST78與ST192、ST64，ST17以及未查到的ST型別均只有1個等位基因的差異（single-locus variant，SLV），因此MALDI-TOF MS對于高度相關(guān)的ST型別，例如SLV，幾乎不能區(qū)分。FREITAS等[17]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用MALDI-TOF MS可區(qū)分屎腸球菌高風險克隆株（ST17、ST18和ST78等）和來自社區(qū)的克隆株（ST5、ST147和ST185）。本研究中的屎腸球菌均分離自醫(yī)院，均屬于CC17克隆復合體，即高風險克隆，后續(xù)需收集更多的菌株，特別是來自社區(qū)的分離株加以驗證。