池宏波， 楊英梅

[1.浙江省臺(tái)州市臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）恩澤醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 318000；2.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院 臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 318000]

結(jié)核病是傳染病的首要死因，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。我國(guó)是全球結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，耐藥結(jié)核病和耐多藥結(jié)核?。ㄓ绕涫抢Ｆ胶彤悷熾码p重耐藥）發(fā)病率和病死率更高，是我國(guó)結(jié)核病防控和治療工作面臨的一大挑戰(zhàn)[2-3]。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的菌種鑒定及耐藥性檢測(cè)對(duì)結(jié)核病的診斷、治療和預(yù)后起著至關(guān)重要的作用。目前，絕對(duì)濃度法、比例法檢測(cè)MTB耐藥性耗時(shí)長(zhǎng)（通常需要4～8 周），不易標(biāo)準(zhǔn)化，而羅氏固體培養(yǎng)法周期長(zhǎng)、操作繁瑣，均易延誤患者的治療?；蛐酒ň哂兴俣瓤臁⑼扛?、靈敏度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，可用于快速篩查耐藥結(jié)核病。本研究采用DNA微陣列芯片法調(diào)查浙江臺(tái)州地區(qū)MTB和非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculousMycobacterium，NTM）的感染情況，及MTB對(duì)利福平和異煙肼的耐藥基因特征，以期為該地區(qū)結(jié)核病（尤其是耐藥結(jié)核?。┑脑\斷和個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年8月—2019年2月恩澤醫(yī)院3 334例患者的各類(lèi)臨床樣本，患者男2 296例、女1 038例，年齡（55±19）歲。臨床樣本來(lái)源包括痰液、穿刺液（胸腹水、腦脊液、心包積液、關(guān)節(jié)液等）、肺泡灌洗液、膿液或分泌物、尿液、脫落細(xì)胞、咽拭子和組織塊等。剔除同一患者相同樣本類(lèi)型的同一分離菌株。

1.2 主要儀器與試劑

E x t r a c t o r 3 6 T M核酸快速提取儀、E-CyclerTM 96 PCR儀、BioMixer II芯片雜交儀、SlideWasherTM芯片洗干儀、LuxScanTM10K/B微陣列芯片掃描儀、分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒、分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）試劑盒、MTB耐藥基因檢測(cè)試劑盒和HybSet基因微陣列芯片雜交盒均購(gòu)自北京博奧生物集團(tuán)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取 采集研究對(duì)象痰液、穿刺液（包括胸腹水、腦脊液、心包積液、關(guān)節(jié)液等）、肺泡灌洗液、膿液或分泌物、尿液、脫落細(xì)胞、咽拭子和組織塊等臨床樣本，采用Extractor36TM核酸快速提取儀，按照分枝桿菌核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行DNA提取和純化。

1.3.2 分枝桿菌菌種鑒定 嚴(yán)格按照分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）試劑盒說(shuō)明書(shū)和儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增、芯片雜交、洗滌甩干和掃描結(jié)果判讀。

1.3.3 MTB耐藥基因檢測(cè) 本研究檢測(cè)指標(biāo)包括利福平及異煙肼的3個(gè)耐藥相關(guān)基因——rpoB基因啟動(dòng)子的野生型及不同突變型，其中利福平耐藥相關(guān)基因rpoB基因檢測(cè)6個(gè)位點(diǎn)，共13種突變型：511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、 531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、533位CTG→CCG。異煙肼耐藥相關(guān)基因katG基因和inhA基因各檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn)，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個(gè)突變型，inhA基因-15位C→T突變型。嚴(yán)格按照MTB耐藥基因檢測(cè)（DNA微陣列芯片法）試劑盒說(shuō)明書(shū)和儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行PCR擴(kuò)增、芯片雜交、洗滌甩干、掃描結(jié)果判讀。以芯片自帶的陰性、陽(yáng)性對(duì)照作為質(zhì)控，陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)rpoBIC、katGIC 、inhAIC應(yīng)為陽(yáng)性，陰性對(duì)照點(diǎn)為陰性則判斷實(shí)驗(yàn)有效，否則判定該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

1.3.4 質(zhì)量控制 PCR擴(kuò)增和芯片雜交設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照，所有操作均嚴(yán)格按照儀器和試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同類(lèi)型樣本分枝桿菌分離情況

3 334 份送檢樣本中，檢出MTB 837株，總檢出陽(yáng)性率為25.10%；檢出NTM 265株，總檢出陽(yáng)性率為7.95%，居前3位的分別為胞內(nèi)分枝桿菌（4.44%）、淺黃分枝桿菌（1.32%）、鳥(niǎo)分枝桿菌（0.75%）。MTB和NTM的樣本來(lái)源均以痰液為主，分別占28.33%和9.12%。見(jiàn)表1。

表1 不同類(lèi)型臨床樣本分枝桿菌分離情況

2.2 不同性別、年齡患者M(jìn)TB檢出情況

不同性別患者M(jìn)TB檢出率不同，男性MTB檢出率為26.88%，高于女性（21.19%）（χ2=12.258，P＜0.05）。不同年齡患者M(jìn)TB的檢出率也不相同（χ2=28.167，P＜0.05），尤其是＜30歲組，MTB檢出率（34.29%）顯著高于30～59歲組（25.56%，χ2=12.765，P＜0.05）與≥60歲組（22.10%，χ2=28.150，P＜0.05），而30～59歲組與≥60歲組MTB的檢出率相近，分別為25.56%和22.10%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.734，P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同性別、年齡患者M(jìn)TB的檢出情況

2.3 MTB耐藥基因特征分析

從837例MTB感染患者中隨機(jī)篩選384例進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，其中對(duì)利福平的耐藥率為8.33%（32/384），對(duì)異煙肼的耐藥率為7.03%（27/384），利福平和異煙肼雙重耐藥率為14.84%（57/384）。89例利福平耐藥樣本中，rpoB基因耐藥位點(diǎn)分布為：511位點(diǎn)占8.99%（8/89），513位點(diǎn)占1.12%（1/89），516位點(diǎn)占8.99%（8/89），526位點(diǎn)占26.97%（24/89），531位點(diǎn)占53.93%（48/89）。84例異煙肼耐藥樣本中，katG基因315位點(diǎn)占91.67%（77/84），inhA基因-15位點(diǎn)占13.10%（11/84）。

3 討論

隨著我國(guó)結(jié)核病患者的增多，結(jié)核病已逐漸呈現(xiàn)出高感染率、高發(fā)病率、高耐藥率和高死亡率等特點(diǎn)[4]。掌握結(jié)核病的疫情和MTB的耐藥情況，對(duì)結(jié)核病的預(yù)防和控制具有重要意義。

本研究3 334份臨床樣本中，MTB的檢出率為25.10%，高于上海地區(qū)的平均水平[5]，NTM的感染率為7.95%，明顯高于青島地區(qū)（2.86%）[6]，提示臺(tái)州地區(qū)MTB和NTM感染相對(duì)較嚴(yán)重，應(yīng)引起足夠的重視。本研究分離的837株MTB和265株NTM的樣本來(lái)源均以痰液為主，提示呼吸系統(tǒng)對(duì)MTB的易感性最強(qiáng)。此外，脫落細(xì)胞和咽拭子中均未檢出MTB和NTM，可能與樣本取材不規(guī)范或樣本數(shù)量過(guò)少有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，男性患者M(jìn)TB的檢出率（26.88%）高于女性（21.19%），可能與男性吸煙人數(shù)相對(duì)較多有關(guān)；不同年齡組中，＜30歲組分枝桿菌檢出率最高（34.29%），其次為30～59歲組（25.56%）。＜30歲人群檢出率最高，可能與該年齡段人群生活壓力較大、作息不規(guī)律、生活習(xí)慣不良等導(dǎo)致其免疫力低下，從而造成的機(jī)會(huì)性感染有關(guān)。因此，應(yīng)加強(qiáng)該年齡段人群結(jié)核病的監(jiān)測(cè)，并及時(shí)采取干預(yù)措施，特別是該年齡段男性人群結(jié)核病的篩檢和預(yù)防。

利福平與異煙肼是最重要的一線抗結(jié)核藥物，檢測(cè)MTB對(duì)利福平與異煙肼的敏感性對(duì)治療具有重要的參考價(jià)值。本研究通過(guò)DNA微陣列芯片法進(jìn)行MTB對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者的總耐藥率為30.20%，單耐藥率為 15.36%，雙重耐藥率為14.84%，均明顯高于賈慶軍等[7]報(bào)道的杭州市的水平，提示臺(tái)州地區(qū)MTB的臨床耐藥情況比較嚴(yán)重，應(yīng)給予足夠的重視，嚴(yán)格按照耐藥類(lèi)型和特點(diǎn)，科學(xué)制定應(yīng)對(duì)方案，選擇有針對(duì)性的抗結(jié)核藥物，有效預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展。

有研究結(jié)果顯示，抗結(jié)核藥物作用的靶基因或靶基因調(diào)控區(qū)發(fā)生基因突變與MTB耐藥高度相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，臺(tái)州地區(qū)利福平耐藥基因rpoB主要優(yōu)勢(shì)突變位點(diǎn)為531位點(diǎn)（53.93%）與526位點(diǎn)（26.97%），異煙肼耐藥基因突變位點(diǎn)主要是katG基因315位點(diǎn)（91.67%），與曾方林等[9]的報(bào)道一致。

本研究仍有一些不足之處，因只是隨機(jī)篩選384株MTB進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，樣本量相對(duì)較少，結(jié)果可能會(huì)存在一定偏移。后續(xù)研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，使結(jié)果更具有代表性。

綜上所述，臺(tái)州地區(qū)的結(jié)核病疫情，尤其是耐藥結(jié)核病疫情較嚴(yán)重。進(jìn)一步加強(qiáng)患者的早發(fā)現(xiàn)、早治療，加強(qiáng)對(duì)結(jié)核病患者的耐藥監(jiān)測(cè)，并采取有針對(duì)性的控制措施，對(duì)于結(jié)核病的預(yù)防和控制意義深遠(yuǎn)而重大。