彭新國， 孫長華， 安佳佳， 崔艷芳， 董 艷， 王 健， 高梅蘭

（濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，山東 濱州 256603）

異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是實體瘤、惡性血液病、免疫缺陷等疾病的有效治療手段。allo-HSCT后造血功能恢復較快，多數(shù)患者在移植后2～3周即可獲得粒細胞和血小板重建，但免疫重建過程卻有所延遲[1]。allo-HSCT后的免疫重建分為固有免疫系統(tǒng)的重建和特異性免疫系統(tǒng)的重建。前者包括粒細胞、單核巨噬細胞等，常在移植后2～4周獲得重建；后者包括T淋巴細胞和B淋巴細胞，移植后重建非常緩慢，尤其是CD4+T細胞[2]。allo-HSCT患者的免疫重建在防止疾病復發(fā)、降低死亡率等方面有重要作用，免疫重建延遲與感染和繼發(fā)腫瘤等密切相關(guān)[3]。侵襲性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）是allo-HSCT后患者死亡的主要原因之一，在機體的抗真菌作用機制中，CD4+T細胞介導的特異性免疫應答發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。外周血中初始CD4+T細胞在不同細胞因子的誘導下，可分化為不同亞群的效應T細胞，各自分泌不同的細胞因子，在免疫應答中執(zhí)行不同功能。為進一步探討allo-HSCT后CD4+T細胞免疫重建特征及其與IFI的關(guān)系，本研究從細胞和細胞因子水平檢測不同亞群效應T細胞相關(guān)指標的變化。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2010年2月—2014年10月濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院行allo-HSCT的血液惡性腫瘤患者47例，其中男33例、女14例，年齡（38±17）歲；47例患者中，急性髓性白血病34例、急性淋巴細胞白血病8例、慢性髓細胞白血病5例；同胞供者移植38例、無血緣供者移植9例；供受者組織相容性白細胞抗原（histocompatibility leukocyte antigen，HLA） 9/10位點以上相合2例、全相合45例；清髓性預處理方案含抗胸腺細胞球蛋白17例、不含30例；急性移植物抗宿主病預防方案為他克莫司+雷帕霉素+嗎替麥考酚酯30例、環(huán)孢素+MTX+MMF17例。另選取同期、同院體檢健康者40名為對照組，其中男28例、女12例，年齡（38±18）歲。

1.2 方法

1.2.1 移植后免疫細胞亞群數(shù)量檢測 采用流式細胞術(shù)檢測移植后免疫細胞亞群數(shù)量。采集研究對象清晨空腹外周血5 mL，肝素抗凝，1 000×g離心5 min，取白細胞膜層，采用密度梯度離心法分離單個核細胞層。以適量RPMI 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+100 U/mL青鏈霉素重懸單個核細胞，細胞濃度為2×106個/mL。將細胞懸液以每管250 μL的量分裝入編號為1、2、3、4、5、6的Eppendorf管中。1、2號管置于37 ℃、5%CO2溫箱孵育4～6 h，1 000×g離心5 min，棄上清，行流式細胞術(shù)。應用BD Diva軟件分析CD4+細胞占淋巴細胞的比例和調(diào)節(jié)性T細胞占CD4+細胞的比例，并結(jié)合外周血淋巴細胞絕對數(shù)計算調(diào)節(jié)性T細胞及CD4+細胞絕對數(shù)。3～6號管中加入1 μL佛波酯/離子霉素混液及1 μL布雷菲萊德菌素A/莫能霉素混液，使4個管內(nèi)終濃度分別為50 ng/mL、1 μg/mL、3 μg/mL及1.4 μg/mL，然后置于37 ℃、5% CO2溫箱孵育4～6 h，1 000×g離心5 min，取上清，行流式細胞術(shù)。應用BD Diva軟件分析輔助性T細胞（helper T cell，Th）17、Th1、Th2占CD4+T細胞的比例，并根據(jù)外周血淋巴細胞絕對數(shù)計算各亞群細胞的絕對數(shù)。所有試劑均購自美國BECKMAN公司，CD4為FITC熒光標記。BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（4/2系統(tǒng)）購自美國BD公司。

1.2.2 細胞因子濃度檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測細胞因子濃度。采集研究對象清晨空腹外周血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，1 000×g離心5 min，取上清，檢測白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、干擾素（interferon，IFN）-γ和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β的濃度。采用美國伯樂公司imark酶標儀進行測定，所有試劑盒均購自美國BioLegend公司，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.3 觀察指標

觀察allo-HSCT后CD4+T細胞免疫重建特征。比較對照者與血液惡性腫瘤患者移植后1、2、3個月的CD4+T細胞、Th17、Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量。觀察連續(xù)3個月均進行檢測的患者的細胞因子水平動態(tài)變化，并與對照組進行比較。觀察患者移植后IFI發(fā)生情況，并分析其與CD4+T細胞免疫重建的相關(guān)性。IFI的診斷標準參照《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標準與治療原則（第五次修訂版）》[5]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SAS 9.3軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，采用獨立樣本的Mann-WhitneyU檢驗；CD4+T細胞免疫重建相關(guān)指標與IFI相關(guān)性分析采用多因素Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 allo-HSCT后不同時間免疫細胞亞群數(shù)量

采用兩方差分析對allo-HSCT后不同時間免疫細胞亞群數(shù)量進行兩兩比較。結(jié)果顯示，移植后1、2和3個月免疫細胞亞群數(shù)量均低于對照組（P＜0.05），移植后2、3個月免疫細胞亞群數(shù)量均高于移植后1個月（P＜0.05）。見表1。

表1 allo-HSCT后不同時間免疫細胞亞群數(shù)量 ×106/L

2.2 allo-HSCT后不同時間細胞因子水平動態(tài)變化

移植后1、2和3個月IL-6水平逐漸升高，且與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），2個月時達到峰值，隨后開始降低，但移植后3個月IL-6水平仍高于對照組（t=10.501，P＜0.001）；與對照組比較，移植后1、2和3個月IL-10水平均升高，移植后2個月較1個月降低，3個月回升至最高，移植后2個月與對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義（t=13.530，P＜0.001）；移植后TGF-β水平下降，移植后1、2和3個月各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；移植后不同時間IFN-γ與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 allo-HSCT后不同時間細胞因子水平 pg/mL

2.3 IFI發(fā)生情況及其與CD4+T細胞免疫重建的相關(guān)性

參照臨床診療結(jié)果，本研究IFI發(fā)生率為19.15%（9/47），其中55.56%（5/9）的病原菌為念珠菌，44.44%（4/9）為曲霉菌；55.56%（5/9）的感染部位為肺部，33.33%（3/9）為口咽部，22.22%（2/9）為腸道（1例患者同時有2個部位發(fā)生感染）。

以是否發(fā)生IFI為因變量，以CD4+T細胞4個亞群細胞數(shù)以及細胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TGF-β為自變量進行多因素Logistic回歸分析，入選標準為0.05，剔除標準為0.1。結(jié)果顯示，Th17細胞數(shù)可能與IFI的發(fā)生有關(guān)，而Th1、Th2和調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)以及IL-6、IL-10、TGF-β和IFN-γ水平與IFI的發(fā)生無關(guān)。見表3。

3 討論

allo-HSCT后，因移植方案中應用了大劑量細胞毒性藥物及長期免疫抑制藥物而影響了免疫重建，患者將經(jīng)歷較長時間的免疫缺陷，從而增加了對病原微生物的易感性[6-7]。IFI是allo-HSCT后常見的嚴重并發(fā)癥，即使給予積極的抗真菌治療，患者仍有較高的發(fā)病率與死亡率[8]。但并非所有的患者都會出現(xiàn)IFI，提示存在某些未知因素導致患者對IFI有個體差異，因此明確IFI與CD4+T細胞免疫重建是否具有相關(guān)性，對幫助臨床制定相應的治療策略具有重要意義。

allo-HSCT后T細胞重建有2條途徑：一條是胸腺依賴性途徑，供者來源的前T細胞在胸腺內(nèi)發(fā)育；另一條是胸腺非依賴性途徑，即成熟T細胞的外周擴增。前者是移植后T細胞的主要來源，產(chǎn)生初始T細胞，啟動緩慢；后者主要是記憶T細胞，能夠在抗原與細胞因子的刺激下迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樾毎瑘?zhí)行免疫應答，是移植后早期淋巴細胞急劇下降、胸腺功能未恢復時的重要替代途徑，在移植后早期的抗感染機制中發(fā)揮著重要作用[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，移植后CD4+T細胞及其免疫亞群數(shù)量隨時間延長而遞增，但移植后3個月亞群細胞數(shù)仍低于對照組，可能與外周血中的初始CD4+T細胞數(shù)量不足有關(guān)。即使受到足夠的抗原或者細胞因子誘導，在無足夠初始CD4+T細胞的情況下，也無法正?；罨癁楦鱽喨杭毎?。此外，也可能是由于移植后患者T細胞受體庫多態(tài)性不足，導致抗原應答能力減弱，向效應T細胞轉(zhuǎn)化的能力減弱及CD4+T細胞亞群重建延遲。

本研究檢測了Th1類因子IFN-γ、Th2類因子IL-6和IL-10、調(diào)節(jié)性T細胞類因子TGF-β，結(jié)果顯示，TGF-β在移植后3個月內(nèi)持續(xù)低于對照組，而IL-6、IL-10在移植后3個月內(nèi)持續(xù)高于對照組，IFN-γ與對照組比較無差異。這可能是由于上述細胞因子除了來源于CD4+T細胞外，還可由移植后恢復較快的單核巨噬細胞、粒細胞等分泌。這些細胞的活化導致某些細胞因子水平不變甚至升高。

本研究結(jié)果顯示，IFI可能與Th17細胞數(shù)有關(guān)，而與Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)以及IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ水平無關(guān)。此外，Th17是IFI發(fā)生的保護因素，提示及時對移植后患者進行Th17檢測，可預測患者IFI發(fā)生率。但本研究受病例數(shù)限制，研究結(jié)果尚需進一步擴大樣本量加以證實。