劉 潔， 趙劍虹， 高 艷， 韓桃利， 李 麗， 孔 毅， 趙煥興， 孫靈利， 王成彬

（1. 北京市朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100021；2. 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)中心，北京 100853；3. 中國(guó)人民解放軍32382部隊(duì)，湖北 武漢 432200）

引起新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）傳染性強(qiáng)、傳播速度快，目前尚無(wú)特效藥物用于治療，也無(wú)有效疫苗可以預(yù)防，給世界各國(guó)人民的健康和國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了重大損害。COVID-19患者的早發(fā)現(xiàn)、早隔離是疫情防控最有效的方法，而作為COVID-19確診“金標(biāo)準(zhǔn)”的核酸檢測(cè)是疾病早期發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)。出于對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)過(guò)程中生物安全的考慮，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室生物安全及核酸檢測(cè)指南或?qū)＜夜沧R(shí)都強(qiáng)調(diào)了核酸檢測(cè)前生物樣本病毒滅活處理的重要性[1-3]。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道加溫滅活樣本對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)沒(méi)有影響[4]，但目前有較多臨床專(zhuān)家提出核酸檢測(cè)用于確診COVID-19假陰性率偏高的問(wèn)題，有一線(xiàn)檢驗(yàn)專(zhuān)家提出加溫滅活可能影響SARS-CoV-2核酸檢測(cè)效率，從而導(dǎo)致了SARSCoV-2核酸檢測(cè)的假陰性結(jié)果[5]。本研究擬驗(yàn)證樣本加溫滅活對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

收集采集自北京市定點(diǎn)醫(yī)院COVID-19患者和社區(qū)密切接觸者SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性的咽拭子樣本10例。病毒采樣管（貨號(hào)MT0301-3）購(gòu)自北京友康公司，內(nèi)含3.5 mL病毒采樣液，主要成分為Hank's液。

1.2 不同加熱裝置升溫實(shí)驗(yàn)

選取實(shí)驗(yàn)室通常使用的水浴箱和空氣溫箱進(jìn)行咽拭子樣本升溫實(shí)驗(yàn)。將室溫放置的病毒采樣管分別放入已經(jīng)升溫至56 ℃的不同加熱裝置中，將數(shù)據(jù)采集溫度計(jì)（型號(hào)932B，美國(guó)Tegam公司）連接溫度傳感器微型探頭（型號(hào)80141，美國(guó)Tegam公司）置于采樣管內(nèi)病毒采樣液中，在線(xiàn)監(jiān)測(cè)溫度變化，記錄從室溫上升至目標(biāo)溫度（56 ℃）所需的時(shí)間。水浴箱、空氣溫箱、數(shù)據(jù)采集溫度計(jì)和溫度傳感器均經(jīng)計(jì)量機(jī)構(gòu)檢定和校準(zhǔn)，并在使用前進(jìn)行溫度標(biāo)定。

1.3 病毒滅活實(shí)驗(yàn)

將SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性咽拭子采樣液各分裝2份，一份升至目標(biāo)溫度（56 ℃）后加熱30 min滅活（56 ℃滅活處理組），另一份室溫放置作為對(duì)照（未滅活處理組）。

1.4 核酸提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

采用MagMAX Express 96全自動(dòng)核酸提取儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）及病毒DNA/RNA磁珠法提取試劑盒（批號(hào)VRNT20200112，長(zhǎng)春博坤生物公司）提取SARS-CoV-2 RNA。采用QuantStudio5 PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（批號(hào)20200124A，上海伯杰公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，加入樣本核酸5 μL，體系配制和擴(kuò)增條件均按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同加熱裝置的升溫時(shí)間

空氣溫箱溫度穩(wěn)定在56 ℃時(shí)，病毒采樣管中采樣液由室溫24.32 ℃升溫至56.02 ℃用時(shí)68 min，見(jiàn)圖1；水浴箱溫度穩(wěn)定在56 ℃時(shí)，采樣液由室溫25.37 ℃升溫至56.00 ℃用時(shí)11.5 min，見(jiàn)圖2。

圖1 采樣液在空氣溫箱內(nèi)的升溫曲線(xiàn)

圖2 采樣液在水浴箱內(nèi)的升溫曲線(xiàn)

2.2 不同溫度滅活后的核酸檢測(cè)結(jié)果

本研究共收集SARS-CoV-2陽(yáng)性咽拭子樣本10例，將樣本平行分為56 ℃滅活處理組和未滅活處理組，同時(shí)進(jìn)行核酸提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溫度滅活咽拭子樣本后的核酸檢測(cè)結(jié)果

對(duì)比SARS-CoV-2 3個(gè)不同基因位點(diǎn)的Ct值，可以發(fā)現(xiàn)加溫滅活處理過(guò)的咽拭子樣本核酸檢測(cè)結(jié)果均會(huì)出現(xiàn)Ct值增加的情況，2個(gè)組ORF1a/b基因Ct值差異為2.12～7.22個(gè)循環(huán)，均值為4.25個(gè)循環(huán)；N基因Ct值差異為0.85～7.07個(gè)循環(huán)，均值為3.16個(gè)循環(huán)；E基因Ct值差異為0.6～4.54個(gè)循環(huán)，均值為2.10個(gè)循環(huán)；10例未經(jīng)滅活處理的樣本，經(jīng)56 ℃滅活處理后，有8例樣本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，2例為陰性；1號(hào)和2號(hào)樣本核酸濃度低，原始Ct值較高，未經(jīng)滅活處理的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，但經(jīng)56 ℃滅活處理后，檢測(cè)結(jié)果變?yōu)殛幮裕▓D3）；核酸濃度高、原始Ct值較低的樣本，加溫處理方式對(duì)Ct值有影響，但不影響核酸陽(yáng)性定性（圖4）。對(duì)未滅活處理和56 ℃滅活處理樣本的ORF1a/b基因、N基因和E基因的Ct值分別進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002、0.01、0.03），見(jiàn)圖5。

圖3 2個(gè)組低濃度樣本PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 高濃度樣本PCR擴(kuò)增結(jié)果（10號(hào)樣本）

圖5 加溫處理后3個(gè)基因檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

目前，對(duì)于SARS-CoV-2理化特性的認(rèn)識(shí)仍然來(lái)自于對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）的研究。前期的研究結(jié)果表明，SARS-CoV和MERS-CoV對(duì)熱敏感，56 ℃ 30 min可以有效滅活病毒[1]。根據(jù)現(xiàn)行的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)專(zhuān)家共識(shí)，樣本在56 ℃ 45 min滅活后進(jìn)行檢測(cè)，可以有效降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，但同時(shí)也提示增加病毒滅活步驟可能會(huì)降低核酸檢測(cè)的敏感性[2]。對(duì)于前期樣本加溫滅活是否會(huì)對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果造成影響，目前尚沒(méi)有明確結(jié)論。

本研究評(píng)價(jià)了56 ℃ 30 min滅活對(duì)咽拭子樣本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)與未滅活處理樣本比較，加溫處理過(guò)的咽拭子樣本，核酸檢測(cè)結(jié)果Ct值會(huì)增加，或PCR曲線(xiàn)峰型不佳，可能造成低載量樣本出現(xiàn)假陰性結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)與之前文獻(xiàn)報(bào)道[4]結(jié)果不一致。應(yīng)該注意以下2點(diǎn)：（1）需要明確滅活的溫度和時(shí)間。之前對(duì)于樣本滅活只是籠統(tǒng)地建議56 ℃30～45 min，但本研究發(fā)現(xiàn)，不同升溫裝置將樣本從室溫加熱到56 ℃的時(shí)間有很大的差異，而不同樣本量達(dá)到目標(biāo)溫度的時(shí)間可能也會(huì)不同。如果使用空氣溫箱加溫，將單支樣本放入溫箱后30 min或45 min，樣本內(nèi)部尚不能達(dá)到56℃，在此情況下進(jìn)行核酸檢測(cè)，不僅不能保證病毒的滅活達(dá)到生物安全要求，而且還可能影響病毒核酸的提取和擴(kuò)增。即使用對(duì)樣本加溫較快的水浴箱，單支采樣管內(nèi)的溫度從室溫升至56 ℃也需要超過(guò)10 min。如果大批量樣本一起加溫，升溫速度會(huì)受到更大的影響，并且樣本在升溫裝置中不同的擺放方式和位置對(duì)升溫速度的影響如何也未進(jìn)行過(guò)驗(yàn)證，這些都是我們?cè)趯?shí)際工作中需要驗(yàn)證和考慮的。（2）病毒采樣液的選擇。本研究使用的病毒采樣液是日常工作中最常用的Hank's液，有研究發(fā)現(xiàn)使用Hank's液保存的豬流行性腹瀉冠狀病毒樣本經(jīng)過(guò)56 ℃孵育30 min后，冠狀病毒核酸損失了50%，而加熱到92 ℃后5 min，可檢出的冠狀病毒核酸損失超過(guò)96%[6]，與本研究結(jié)果一致。這是否意味著冠狀病毒的核酸結(jié)構(gòu)對(duì)熱具有不穩(wěn)定性，或者還受其他因素的影響，有待于進(jìn)一步研究。