劉 潔， 趙劍虹， 高 艷， 韓桃利， 李 麗， 孔 毅， 趙煥興， 孫靈利， 王成彬

（1. 北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100021；2. 中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)中心，北京 100853；3. 中國人民解放軍32382部隊(duì)，湖北 武漢 432200）

引起新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）傳染性強(qiáng)、傳播速度快，目前尚無特效藥物用于治療，也無有效疫苗可以預(yù)防，給世界各國人民的健康和國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了重大損害。COVID-19患者的早發(fā)現(xiàn)、早隔離是疫情防控最有效的方法，而作為COVID-19確診“金標(biāo)準(zhǔn)”的核酸檢測是疾病早期發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)。出于對SARS-CoV-2核酸檢測過程中生物安全的考慮，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室生物安全及核酸檢測指南或?qū)＜夜沧R都強(qiáng)調(diào)了核酸檢測前生物樣本病毒滅活處理的重要性[1-3]。雖然有文獻(xiàn)報道加溫滅活樣本對SARS-CoV-2核酸檢測沒有影響[4]，但目前有較多臨床專家提出核酸檢測用于確診COVID-19假陰性率偏高的問題，有一線檢驗(yàn)專家提出加溫滅活可能影響SARS-CoV-2核酸檢測效率，從而導(dǎo)致了SARSCoV-2核酸檢測的假陰性結(jié)果[5]。本研究擬驗(yàn)證樣本加溫滅活對SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

收集采集自北京市定點(diǎn)醫(yī)院COVID-19患者和社區(qū)密切接觸者SARS-CoV-2核酸檢測陽性的咽拭子樣本10例。病毒采樣管（貨號MT0301-3）購自北京友康公司，內(nèi)含3.5 mL病毒采樣液，主要成分為Hank's液。

1.2 不同加熱裝置升溫實(shí)驗(yàn)

選取實(shí)驗(yàn)室通常使用的水浴箱和空氣溫箱進(jìn)行咽拭子樣本升溫實(shí)驗(yàn)。將室溫放置的病毒采樣管分別放入已經(jīng)升溫至56 ℃的不同加熱裝置中，將數(shù)據(jù)采集溫度計（型號932B，美國Tegam公司）連接溫度傳感器微型探頭（型號80141，美國Tegam公司）置于采樣管內(nèi)病毒采樣液中，在線監(jiān)測溫度變化，記錄從室溫上升至目標(biāo)溫度（56 ℃）所需的時間。水浴箱、空氣溫箱、數(shù)據(jù)采集溫度計和溫度傳感器均經(jīng)計量機(jī)構(gòu)檢定和校準(zhǔn)，并在使用前進(jìn)行溫度標(biāo)定。

1.3 病毒滅活實(shí)驗(yàn)

將SARS-CoV-2核酸陽性咽拭子采樣液各分裝2份，一份升至目標(biāo)溫度（56 ℃）后加熱30 min滅活（56 ℃滅活處理組），另一份室溫放置作為對照（未滅活處理組）。

1.4 核酸提取和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

采用MagMAX Express 96全自動核酸提取儀（美國Applied Biosystems公司）及病毒DNA/RNA磁珠法提取試劑盒（批號VRNT20200112，長春博坤生物公司）提取SARS-CoV-2 RNA。采用QuantStudio5 PCR擴(kuò)增儀（美國Thermo Fisher公司）及實(shí)時熒光定量PCR試劑盒（批號20200124A，上海伯杰公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，加入樣本核酸5 μL，體系配制和擴(kuò)增條件均按試劑說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同加熱裝置的升溫時間

空氣溫箱溫度穩(wěn)定在56 ℃時，病毒采樣管中采樣液由室溫24.32 ℃升溫至56.02 ℃用時68 min，見圖1；水浴箱溫度穩(wěn)定在56 ℃時，采樣液由室溫25.37 ℃升溫至56.00 ℃用時11.5 min，見圖2。

圖1 采樣液在空氣溫箱內(nèi)的升溫曲線

圖2 采樣液在水浴箱內(nèi)的升溫曲線

2.2 不同溫度滅活后的核酸檢測結(jié)果

本研究共收集SARS-CoV-2陽性咽拭子樣本10例，將樣本平行分為56 ℃滅活處理組和未滅活處理組，同時進(jìn)行核酸提取和實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見表1。

表1 不同溫度滅活咽拭子樣本后的核酸檢測結(jié)果

對比SARS-CoV-2 3個不同基因位點(diǎn)的Ct值，可以發(fā)現(xiàn)加溫滅活處理過的咽拭子樣本核酸檢測結(jié)果均會出現(xiàn)Ct值增加的情況，2個組ORF1a/b基因Ct值差異為2.12～7.22個循環(huán)，均值為4.25個循環(huán)；N基因Ct值差異為0.85～7.07個循環(huán)，均值為3.16個循環(huán)；E基因Ct值差異為0.6～4.54個循環(huán)，均值為2.10個循環(huán)；10例未經(jīng)滅活處理的樣本，經(jīng)56 ℃滅活處理后，有8例樣本檢測結(jié)果為陽性，2例為陰性；1號和2號樣本核酸濃度低，原始Ct值較高，未經(jīng)滅活處理的檢測結(jié)果為陽性，但經(jīng)56 ℃滅活處理后，檢測結(jié)果變?yōu)殛幮裕▓D3）；核酸濃度高、原始Ct值較低的樣本，加溫處理方式對Ct值有影響，但不影響核酸陽性定性（圖4）。對未滅活處理和56 ℃滅活處理樣本的ORF1a/b基因、N基因和E基因的Ct值分別進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002、0.01、0.03），見圖5。

圖3 2個組低濃度樣本PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 高濃度樣本PCR擴(kuò)增結(jié)果（10號樣本）

圖5 加溫處理后3個基因檢測結(jié)果比較

3 討論

目前，對于SARS-CoV-2理化特性的認(rèn)識仍然來自于對嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）的研究。前期的研究結(jié)果表明，SARS-CoV和MERS-CoV對熱敏感，56 ℃ 30 min可以有效滅活病毒[1]。根據(jù)現(xiàn)行的SARS-CoV-2核酸檢測專家共識，樣本在56 ℃ 45 min滅活后進(jìn)行檢測，可以有效降低生物安全風(fēng)險，但同時也提示增加病毒滅活步驟可能會降低核酸檢測的敏感性[2]。對于前期樣本加溫滅活是否會對SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果造成影響，目前尚沒有明確結(jié)論。

本研究評價了56 ℃ 30 min滅活對咽拭子樣本SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)與未滅活處理樣本比較，加溫處理過的咽拭子樣本，核酸檢測結(jié)果Ct值會增加，或PCR曲線峰型不佳，可能造成低載量樣本出現(xiàn)假陰性結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)與之前文獻(xiàn)報道[4]結(jié)果不一致。應(yīng)該注意以下2點(diǎn)：（1）需要明確滅活的溫度和時間。之前對于樣本滅活只是籠統(tǒng)地建議56 ℃30～45 min，但本研究發(fā)現(xiàn)，不同升溫裝置將樣本從室溫加熱到56 ℃的時間有很大的差異，而不同樣本量達(dá)到目標(biāo)溫度的時間可能也會不同。如果使用空氣溫箱加溫，將單支樣本放入溫箱后30 min或45 min，樣本內(nèi)部尚不能達(dá)到56℃，在此情況下進(jìn)行核酸檢測，不僅不能保證病毒的滅活達(dá)到生物安全要求，而且還可能影響病毒核酸的提取和擴(kuò)增。即使用對樣本加溫較快的水浴箱，單支采樣管內(nèi)的溫度從室溫升至56 ℃也需要超過10 min。如果大批量樣本一起加溫，升溫速度會受到更大的影響，并且樣本在升溫裝置中不同的擺放方式和位置對升溫速度的影響如何也未進(jìn)行過驗(yàn)證，這些都是我們在實(shí)際工作中需要驗(yàn)證和考慮的。（2）病毒采樣液的選擇。本研究使用的病毒采樣液是日常工作中最常用的Hank's液，有研究發(fā)現(xiàn)使用Hank's液保存的豬流行性腹瀉冠狀病毒樣本經(jīng)過56 ℃孵育30 min后，冠狀病毒核酸損失了50%，而加熱到92 ℃后5 min，可檢出的冠狀病毒核酸損失超過96%[6]，與本研究結(jié)果一致。這是否意味著冠狀病毒的核酸結(jié)構(gòu)對熱具有不穩(wěn)定性，或者還受其他因素的影響，有待于進(jìn)一步研究。