王金俠 陳民
遺忘型輕度認知功能障礙(amnestic mild cognitive impairment,aMCI)是介于正常老化與輕度癡呆之間的一種中間過渡狀態(tài),是AD 的早期階段,其患病率因診斷標準不同而差異性較大,約為5%~20%。每年約有15%的aMCI 人群會轉化成癡呆,被認為是癡呆的“預警信號”,他為癡呆的防治提供了一個“機會之窗”[1-2]。目前全基因組關聯(lián)研究已發(fā)現(xiàn)多個染色體區(qū)域很可能存在與AD 有關的基因突變,但只有載脂蛋白E(ApoE)等位基因在世界范圍內(nèi)得到了公認。由于ApoE 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的載脂蛋白,在膽固醇動員、重新分布及排泄等代謝過程中均具有重要作用,因此人們推測血脂代謝紊亂可能參與AD 發(fā)病過程。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食可以加劇巴馬小型豬海馬、大腦皮層中的β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積及增加血清中Aβ 的含量[3-6]。因此,尋找更多的脂代謝相關候選基因,對將來AD 的基因診斷和靶點治療至關重要。相關研究顯示,ApoE、低密度脂蛋白受體(LDLR)、ATP 結合盒轉運蛋白A7(ABCA7)基因多態(tài)性與aMCI 可能存在相關性,但關聯(lián)研究尚處于不確定階段。本研究以aMCI 為研究對象,探討aMCI 脂質代謝相關通路蛋白基因多態(tài)性的分布特征及與aMCI 的關系。
1.1 研究對象 遵循病例對照試驗原則,本研究在2016 年12 月至2018 年3 月間分別從沈陽市2 個三級甲等綜合性醫(yī)院(遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院、沈陽軍區(qū)總醫(yī)院)及6個沈陽市養(yǎng)老中心(沈陽市皇姑區(qū)塔灣新家園敬老院、沈陽市養(yǎng)老院、沈陽市于洪區(qū)中心敬老院、沈陽市蘇家屯區(qū)社會福利院、沈陽市合眾優(yōu)年養(yǎng)老社區(qū)、沈陽市大東區(qū)愛達養(yǎng)老公寓)選取600例有效樣本。其中aMCI病人300例,年齡60~101歲,平均(75.90±11.21)歲,男192 例,女108 例;與之年齡、性別、疾病史相匹配的認知功能正常的老年樣本300例,年齡62~100 歲,平均(73.71±11.87)歲,男189 例,女111 例。所有入選對象均為沈陽地區(qū)常住人口,且均為漢族。本研究由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院倫理委員會通過,所有受試者均簽署知情同意書。
1.2 納入標準和排除標準
1.2.1 aMCI組納入標準:(1)參照美國精神病學會的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊第4修訂版(DSM-Ⅳ)的MCI診斷標準[7],符合aMCI 的診斷標準;(2)年齡≥60 歲;(3)MMSE 評分標準為:文盲16~18 分,小學19~21分,初中22~24分,高中及以上25~27分;HIS 缺血指數(shù)量表(Hachinski,HIS)≤4 分;漢密爾頓抑郁量表(Hamilton Depression Scale,HAMD)≤12 分(17 項量表);臨床癡呆評估(CDR)0或0.5分;Barthel生活活動量表(ADL)≥80 分;(4)無嚴重的心、肺、肝、腎功能障礙;(5)無慢性病急性加重或發(fā)作狀態(tài);(6)無急性感染性疾?。唬?)視力及聽力無明顯障礙,能夠順利完成問卷。
1.2.2 認知正常組納入標準:(1)MMSE 評分標準為:文盲>18 分,小學>21 分,初中>24 分,高中及以上>27 分;HIS 評分≤4 分;HAMD 評分(17 項量表)≤12分;CDR 為0 分;ADL 評分≥80 分。(2)日常生活功能良好。
1.2.3 排除標準:(1)既往有卒中史;(2)血管性癡呆或其他原因導致的癡呆;(3)引起腦功能障礙的其他神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ鏟D、正常腦壓腦積水或腦炎等);(4)認知損害由顱外傷所致;(5)其他可引起認知功能損害的疾病,如嚴重貧血、梅毒、甲狀腺功能異常、艾滋病等;(6)心、肺、肝、腎等功能衰竭,急性感染或重度感染性疾?。唬?)中毒性腦病病人。
1.3 方法
1.3.1 臨床資料采集:收集年齡、性別、受教育程度、疾病史、飲酒史、吸煙史、體育鍛煉、生活方式等資料。
1.3.2 基因分型方法:本項目委托上海天昊生物技術有限公司進行,采用iMLDRTM多重單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型試劑盒對600 個樣本進行5 個SNPs 位點分型。
1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件處理,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用t 檢驗,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用Maim-Whitney U 檢驗;計數(shù)資料用頻次表示,組間比較采用卡方檢驗。探討因變量與多個自變量的關系采用多元回歸分析。以P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 2 組的基本資料比較 aMCI 組的受教育程度、MMSE 評分、ADL 評分皆低于認知正常組,HAMD 評分高于認知正常組,差異均有統(tǒng)計學意義(P <0.05 或P <0.01)。aMCI組的吸煙史、飲酒史病人比例較認知正常組高(P <0.05)。見表1。
表1 2組的一般資料比較(n,n=300)
續(xù)表1
2.2 標簽基因多態(tài)性哈溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡分析 研究中4 個基因共5 個標簽SNPs,通過Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗發(fā)現(xiàn),所有SNPs 均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P >0.05)。
2.3 2 組ApoE ε2、ε3、ε4 基因多態(tài)性分布 2 組間ApoE ε2/2、ε4/4 基因型和ε2、ε4 等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(P <0.01)。見表2。
表2 2組ApoE ε2、ε3、ε4的基因型和等位基因型頻率分布(n,%,n=300)
2.4 2 組LDLR 基因rs688 和rs5925 多態(tài)性分布 2組rs688 基因型分布差異具有統(tǒng)計學意義(P <0.05);aMCI 組C 等位基因頻率高于認知正常組(88.50%比84.00%,P <0.05)。而2 組LDLR rs5925 基因多態(tài)性比較,差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。見表3。
2.5 2 組ABCA7 基因rs3752246 多態(tài)性分布 2 組間ABCA7 rs3752246 基因多態(tài)性比較,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.01)。見表4。
表3 2組LDLR基因rs688和rs5925多態(tài)性分布(n,%,n=300)
表4 2組ABCA7 rs3752246基因多態(tài)性分布(n,%,n=300)
2.6 各基因多態(tài)性與aMCI 相關性的多因素Logistic回歸分析 經(jīng)校正性別、受教育程度、吸煙史、飲酒史、生活方式、體育鍛煉、疾病史等因素后,結果顯示,ApoE ε4等位基因是aMCI的易感等位基因,aMCI發(fā)病率是非ε4 攜帶者的1.453 倍;ε2 等位基因是aMCI 的保護等位基因,aMCI 發(fā)病率是非ε2 攜帶者的0.498倍。ABCA7 的rs3752246 基因多態(tài)性與aMCI 發(fā)病存在明顯相關性,C 等位基因攜帶者是非攜帶者發(fā)病率的2.092 倍。LDLR 的rs688 基因多態(tài)性與aMCI 發(fā)病存在明顯相關性,T 等位基因攜帶者是非攜帶者發(fā)病率的1.356倍。見表5。
ApoE 是一種載脂蛋白,其基因位于19 號染色體上,在人群中呈多態(tài)性。其遺傳多態(tài)性主要受控于兩個SNP 位點rs429358 和rs7412,并通過不同的核酸組合決定了ApoE 的3 種等位基因型:ε2、ε3、ε4[8]。ApoE ε4 等位基因是遲發(fā)型AD 的主要遺傳風險因素,攜帶ε4 等位基因者發(fā)展為AD 的風險增加2~3 倍[9]。與非ε4 個體相比,ε4 攜帶者早在40 歲時即表現(xiàn)出腦淀粉樣蛋白病理改變并且經(jīng)歷更快的認知下降[10]。另外,ApoE ε4 還可促使腦內(nèi)tau 蛋白發(fā)生異常磷酸化,形成神經(jīng)纖維纏結(NFT)。有研究將鼠ApoE 基因敲除后,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元突觸完整性和可塑性受到影響;將老齡鼠ApoE 基因敲除后,其表現(xiàn)出類似AD 的一些特征:膽堿能神經(jīng)元丟失、過多脂質氧化、認知紊亂、突觸丟失、異常tau 蛋白磷酸化等。在本研究中也發(fā)現(xiàn),ApoE 基因多態(tài)性確實與aMCI 發(fā)病相關,ApoE ε4是aMCI 發(fā)病的危險因素,而ApoE ε2 則是保護性因素。
表5 各基因多態(tài)性與aMCI相關性的多因素Logistic回歸分析
LDLR 基因位于人類第19 號染色體短臂末端(p13.1-p13.3),全長45 kb,由18 個外顯子和17 個內(nèi)含子構成。rs5925位點位于LDLR 第18個外顯子NocI限制性酶切多態(tài)位點,rs5925位點基因多態(tài)性與TC 和LDL 水平間有明顯的劑量效應關系,LDLR 基因rs688位點位于LDLR 基因的第12 個外顯子中[11]。LDLR 在AD 發(fā)病機制中的作用,特別是在晚發(fā)性AD 中,在過去25 年里被遺傳、神經(jīng)病理學和生物標志物分析(臨床研究)或細胞和動物模型系統(tǒng)(臨床前研究)研究最多。雖然有一些矛盾的報道,但越來越多的證據(jù)表明,LDLR不僅能調節(jié)大腦和外周的Aβ,還能維護大腦內(nèi)穩(wěn)態(tài),延緩AD 的發(fā)病。雖然LDLR rs688 基因多態(tài)性對認知障礙的機制并不是很明確,但是有幾條證據(jù)表明LDLR 基因多態(tài)性是與AD 有關的優(yōu)良候選基因。首先,LDLR 是ApoE 的主要腦受體,其等位基因已被廣泛接受用于調節(jié)AD 風險[12-13]。其次,LDLR 缺乏與Tg2576 APP 轉基因小鼠中Aβ 沉積增加有關,盡管不是PD APP 轉基因小鼠,但暗示LDLR 和AD 標記之間可能存在聯(lián)系。第三,小鼠LDLR 缺乏與學習能力不足有關。最后,rs688 基因多態(tài)性都與膽固醇穩(wěn)態(tài)有關,膽固醇穩(wěn)態(tài)本身與Aβ 的產(chǎn)生和AD 風險有關[14]。在本研究中也發(fā)現(xiàn),rs688 確實與aMCI 發(fā)病相關,rs688 T等位基因是aMCI發(fā)病的易感等位基因。
ABCA7 基因位于染色體19p13.3。ABCA7 可促進膽固醇外流和抑制Aβ分泌,并能通過C1q補體途徑增強巨噬凋亡細胞的功能。ABCA7 是大腦小膠質細胞和神經(jīng)元表達的轉運蛋白大家族的一部分。研究結果證明,ABCA7 通過增強吞噬Aβ、凋亡細胞和合成底物的作用來降低AD 的危險性[15];也有研究顯示,ABCA7通過清除Aβ沉積來降低AD的危險性[16-18]。本研究結果表明,ABCA7 rs3752246 C 等位基因是aMCI發(fā)病的易感等位基因。
ApoE、LDLR、ABCA7 基因多態(tài)性與aMCI 的發(fā)病確實存在相關性,但其在認知障礙發(fā)病機制中的作用還有待進一步闡明。