李永麗 王亞紅 常 樂 余海如 周 洲 趙文霞 曲良建

(1. 河南科技大學林學院 洛陽 471003； 2. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所 國家林業(yè)和草原局森林保護學重點實驗室 北京 100091)

新疆野蘋果(Malussieversii)又名塞威氏蘋果，是我國乃至世界的重要野生蘋果樹基因庫，為現(xiàn)代栽培蘋果的原始祖先(閆鵬等， 2016)。在長期的進化過程中，新疆野蘋果積累和擁有豐富的遺傳多樣性，因其具有抗旱、抗寒、抗病蟲和耐瘠薄等特點(馬闖等， 2018)，引起眾多研究者的關注。

目前，國內外關于新疆野蘋果的研究集中在形態(tài)學、孢粉學和細胞學等方面(田潤煒， 2016)，對其內生細菌分離、鑒定和應用的研究尚未見報道。植物內生細菌廣泛分布于植物組織內，前人在水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和棉花(Gossypiumhirsutum)等作物中均已篩選獲得具有生防作用的內生細菌(文才藝等， 2004)，研究證實內生細菌對宿主植物具有防病、促生、固氮和抗逆境等作用(鄒文欣等， 2001)，可作為重要的生防資源加以開發(fā)利用。然而對蘋果病害具有生防作用的蘋果內生細菌分離篩選的研究(尹寶重等， 2017)鮮有報道。本研究對新疆野蘋果內生細菌進行分離和篩選，以期獲得對蘋果病害具有生防作用的菌株，可為蘋果病害生物防治提供新菌種資源和方法參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新疆野蘋果健康枝條采集于新疆伊利河谷鞏留縣交勒賽野果林，海拔1 325 m，地理坐標43.232°N，82.778°E。

蘋果病害病原菌： 葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和蘋果擬莖點霉(Phomopsismali)均由河南科技大學林學院林業(yè)生物技術實驗室分離保存。

內生細菌分離培養(yǎng)基： NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基(方中達，1998)、LB培養(yǎng)基(蘇靜， 2007)、MEA培養(yǎng)基(徐濤， 2012)、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基(RBA)(王勇等， 2008)、水瓊脂培養(yǎng)基(WA)(王勇等， 2008)、MS培養(yǎng)基(Murashigeetal., 1962)、AT培養(yǎng)基(周婧， 2013)。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生細菌的分離與純化 取新疆野蘋果2年生枝條24枝，韌皮部和木質部分別剪成5 mm×5 mm 左右的組織塊，75%的酒精消毒30 s，1%次氯酸鈉消毒3 min，無菌水漂洗3次后，組織塊(576塊)分別放置于各培養(yǎng)基表面； 同時，用稀釋分離法(組織塊320塊)分離內生菌(方中達，1998)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中無光照培養(yǎng)，取最后一次漂洗的無菌水作為對照涂布于培養(yǎng)基表面，室內連續(xù)觀察內生細菌生長情況，適時挑取不同形態(tài)特征的菌落劃線于PDA培養(yǎng)基上，純化3次后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性測定 采用平板對峙試驗，篩選具有抑菌活性的內生細菌。初次篩選： 在PDA平板中央放置病原菌菌餅(直徑7 mm)，將不同內生細菌菌株距其2.5 cm處上下左右4個方向各劃1 cm長的菌線，每處理重復3次，未劃菌線的作為對照組。2～3天后，測量菌落直徑并計算抑菌率。抑菌率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。經初次篩選獲得具有抑菌作用的菌株進行再次篩選。將菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)至OD值2.0(λ=600 nm)。在PDA培養(yǎng)基中央放置病原菌菌餅，菌餅上下左右4個方向放置濾紙片(直徑5 mm)，濾紙片距離菌餅2.5 cm，每個濾紙片滴加3 μL內生細菌菌液，每處理重復3次，未放置濾紙的作為對照組。2～3天后，測量菌落直徑并計算抑菌率。

1.2.3 致病性測定 選擇健康的蘋果Maluspumila)紅富士品種2年生枝條，截成40 cm長的枝段，經75%酒精表面消毒，無菌水沖洗3次，自然晾干后頂端用石蠟封頂。每個枝條作3處燙傷，將篩選出的內生細菌菌株10 μL(108cfu·mL-1)滴于燙傷處。待菌液自然晾干后，用無菌濕潤的脫脂棉附在傷口處，保鮮膜包裹，下端插入自來水中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度不低于80%。傷口滴加10 μL無菌水作為陰性對照，傷口放置蘋果擬莖點霉菌餅的作為陽性對照。觀察接種部位發(fā)病情況，25天后統(tǒng)計枝條傷口發(fā)病數(shù)量，計算發(fā)病率，發(fā)病率=(發(fā)病傷口數(shù)/總的傷口數(shù))×100%。

1.2.4 菌株鑒定 1)形態(tài)學及生理生化鑒定 對篩選出的內生細菌菌株進行形態(tài)學及生理生化鑒定，方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等， 2001)。

2) 16S rDNA基因序列測定 提取內生細菌菌株基因組DNA后，對16S rDNA序列進行擴增，引物為16SL(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACCT-3′)和16SR(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，擴增程序為95 ℃預變性3 min； 98 ℃變性10 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共43個循環(huán)； 72 ℃延伸7 min。將擴增出的目的片段由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果在GenBank數(shù)據庫中進行Blast相似性比對，下載同源性較高的相關菌株序列，使用Clustal X2進行多序列比對，用MEGA 4.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 試驗分析與統(tǒng)計方法 按照文中公式計算抑菌率，數(shù)據采用Spss 18.0軟件進行方差分析，Oneway ANOVA法進行顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 新疆野蘋果枝干內生細菌分離

用8種不同培養(yǎng)基從新疆野蘋果韌皮部和木質部中共培養(yǎng)出內生細菌217株。不同培養(yǎng)基和枝條不同組織分離得到的內生細菌數(shù)量有所不同(表1)，從木質部和韌皮部分離內生細菌菌株數(shù)的比例約為2∶1。AT培養(yǎng)基上未分離到內生細菌，孟加拉紅培養(yǎng)基未分離到韌皮部內生細菌，其他培養(yǎng)基在韌皮部和木質部均分離出內生細菌。

表1 不同培養(yǎng)基和不同組織分離到的內生細菌菌株數(shù)量

圖1 內生細菌對3種蘋果病原菌抑菌效果

2.2 新疆野蘋果內生細菌抑菌活性測定

2.2.1 拮抗菌株初次篩選 對217株內生細菌進行平板對峙試驗，發(fā)現(xiàn)不同菌株對3種蘋果病原菌的抑菌效果不同。其中24株內生細菌對葡萄座腔菌有拮抗作用，34株對膠孢炭疽菌有拮抗作用，45株對蘋果擬莖點霉有拮抗作用。選取對3種病原菌均有較高抑菌率的18株內生細菌進行再次篩選，其中11株木質部內生細菌，7株韌皮部內生細菌，菌株編號為L-m6、L-m12、L-m19、L-m23、P-m1、P-m7、P-m9、P-m11、P-r14、P-r16、P-r17、P-r21、M-m7、M-m12、M-m19、M-r12、M-r14和M-r16。

2.2.2 拮抗菌株再次篩選 平板對峙法檢測18株內生細菌對3種蘋果病原菌的抑菌效果(圖1)。其中，14株內生細菌對葡萄座腔菌抑菌率較高，10株抑菌率在60%～70%之間，4株抑菌率高于70%，最大抑菌率為77%。9株內生細菌對膠孢炭疽菌具有明顯的抑制作用，抑菌率均大于55%，最大抑菌率為68.87%。18株內生細菌均對蘋果擬莖點霉表現(xiàn)出較強抑制活性，抑菌率均高于60%，其中9株抑菌率在70%以上，最大抑菌率為79.22%。

圖2 7株高抑菌率內生細菌對3種蘋果病原菌的拮抗作用

對抑菌率綜合分析，有7個菌株即M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、L-m12、P-r21對3種蘋果病原菌均具有明顯的抑菌效果(圖2)，對葡萄座腔菌的抑菌率分別為77.00%、72.60%、76.60%、60.64%、65.96%、65.81%、71.79%； 對膠孢炭疽菌的抑菌率分別為 69.85%、64.95%、68.87%、68.37%、56.12%、53.54%、65.66%； 對蘋果擬莖點霉的抑菌率分別為77.63%、79.22%、72.60%、69.37%、70.27%、69.30%和71.05%。

2.3 內生細菌致病性測定

對上述7株內生細菌進行致病性分析，陽性對照發(fā)病率為100%，陰性對照組和菌株M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、L-m12、P-r21發(fā)病率均為0，表明7株內生細菌對蘋果枝條無致病性。

2.4 新疆野蘋果內生細菌的鑒定

2.4.1 形態(tài)特征 菌株M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、L-m12、P-r21，在NA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)2天，觀察記錄菌落形態(tài)(表2)。7株內生拮抗細菌，菌體均為桿狀，有芽孢，周生鞭毛。

表2 內生細菌菌落特征

2.4.2 生理生化特征 7株內生細菌的生理生化特征見表3。根據內生細菌形態(tài)特征及生理生化特征(東秀珠等， 2001； Idrissetal., 2002； Clercketal., 2004； 楊可等， 2018)，初步鑒定菌株M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、L-m12、P-r21屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。M-m7、M-m12、P-m11、L-m12為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，M-r12、P-m9為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)，P-r21為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

2.4.3 菌株16SrDNA序列分析 菌株M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、P-r21、L-m12的16S rDNA擴增產物經測序分別獲得大小為1 421、1 423、1 418、1 423、1 424、1 425、1 417 bp的序列。通過NCBI數(shù)據庫中的BLAST同源進化分析，M-m7(16S rDNA收錄號： MK660023)、M-m12(16S rDNA收錄號： MK660029)與枯草芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： MH362700)相似性100%； M-r12(16S rDNA收錄號： MK660024)與貝萊斯芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： CP031880)相似性99%； P-m9(16S rDNA收錄號： MK660028)與貝萊斯芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： MH503854)相似性100%； P-m11(16S rDNA收錄號： MK660025)與枯草芽孢桿菌(B.subtilissubsp.subtilisstrain SML_M159)(16S rDNA收錄號： MG937689)相似性100%； P-r21(16S rDNA收錄號： MK660027)與解淀粉芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： CP031424)相似性100%； L-m12(16S rDNA收錄號： MK660026)與枯草芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： JQ978219)相似性100%。

表3 內生細菌生理生化特征①

①+: 陽性Positive； -: 陰性Negative； ND: 未做試驗Not tested.

結合細菌形態(tài)特征、生理生化特征，及16S rDNA序列分析結果，最終鑒定M-m7、M-m12、P-m11、L-m12為枯草芽孢桿菌，M-r12、P-m9為貝萊斯芽孢桿菌，P-r21為解淀粉芽孢桿菌。7株內生菌均于河南科技大學林學院林業(yè)生物技術實驗室保存。

3 討論

目前，關于新疆野蘋果的研究多集中在種群、生態(tài)及遺傳特性方面(田潤煒等， 2016； 陳學森等， 2006； 吳傳金等， 2008； 馮濤等， 2006)，在其種子萌發(fā)特性(閆秀娜等， 2015)、繁育特性(秦偉等， 2010)、植株脅迫(徐彥等， 2010； 于瑋瑋等， 2016)和種質資源(秦偉等， 2011)等方面取得了較多研究成果，而有關新疆野蘋果內生菌的研究鮮有報道。李芳等(2015)為抑制新疆野蘋果組織培養(yǎng)時產生的內生菌，曾分離鑒定了11株新疆野蘋果內生真菌，未涉及篩選對植物病害具有拮抗作用的內生細菌； 關于新疆野蘋果內生細菌尤其具生防潛力的內生細菌研究至今尚未見報道。本研究從新疆野蘋果枝條共分離出內生細菌217株，篩選和鑒定出對3種蘋果病原菌均表現(xiàn)出較強抑菌作用的內生細菌7株，這些內生細菌菌株抑菌率高，且抗菌譜廣，對葡萄座腔菌、膠孢炭疽菌、蘋果擬莖點霉抑菌率分別在60%、53%、69%以上。

芽孢桿菌因可產生抗逆性的芽孢，性能穩(wěn)定，具有耐熱、抗旱、耐紫外線照射等特性，成為理想的生防菌篩選對象(彭兵等， 2011)。利用芽孢桿菌研制的生防制劑目前也已廣泛應用于植物病害的防治(李秀明， 2013)，如Pleban等(1995)利用內生芽孢桿菌防治溫室蔬菜病害。本研究篩選出的7株內生細菌均屬芽孢桿菌屬，且對蘋果樹上的3種病原菌均具有較強的抑菌作用，通過離體接種試驗證實對蘋果不具致病性，具有作為生防菌株防治蘋果病害的潛力。

許多內生芽孢桿菌菌株不僅具有防病作用，而且具有促進植物生長等多種功能(Chungetal.， 2015； Romeroetal.， 2016)，本研究中篩選獲得的7株芽孢桿菌是否具有其他作用尚有待于進一步研究。

4 結論

本研究從新疆野蘋果中分離篩選出對蘋果的3種病原菌具有較強抑制作用的優(yōu)良內生細菌菌株7株，并根據形態(tài)學、生理生化特性和分子特征對它們進行了鑒定，M-m7、M-m12、P-m11、L-m12為枯草芽孢桿菌，M-r12、P-m9為貝萊斯芽孢桿菌，P-r21為解淀粉芽孢桿菌。經平板對峙試驗證實這7株內生細菌對蘋果樹病原菌葡萄座腔菌、膠孢炭疽菌、蘋果擬莖點霉均具有顯著的抑菌效果，并且無致病性。研究為蘋果病害的生物防治提供了菌種資源，為新疆野蘋果內生菌的開發(fā)利用奠定了基礎。