李永麗 王亞紅 常 樂 余海如 周 洲 趙文霞 曲良建

(1. 河南科技大學林學院 洛陽 471003； 2. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所 國家林業(yè)和草原局森林保護學重點實驗室 北京 100091)

新疆野蘋果(Malussieversii)又名塞威氏蘋果，是我國乃至世界的重要野生蘋果樹基因庫，為現(xiàn)代栽培蘋果的原始祖先(閆鵬等， 2016)。在長期的進化過程中，新疆野蘋果積累和擁有豐富的遺傳多樣性，因其具有抗旱、抗寒、抗病蟲和耐瘠薄等特點(馬闖等， 2018)，引起眾多研究者的關(guān)注。

目前，國內(nèi)外關(guān)于新疆野蘋果的研究集中在形態(tài)學、孢粉學和細胞學等方面(田潤煒， 2016)，對其內(nèi)生細菌分離、鑒定和應用的研究尚未見報道。植物內(nèi)生細菌廣泛分布于植物組織內(nèi)，前人在水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和棉花(Gossypiumhirsutum)等作物中均已篩選獲得具有生防作用的內(nèi)生細菌(文才藝等， 2004)，研究證實內(nèi)生細菌對宿主植物具有防病、促生、固氮和抗逆境等作用(鄒文欣等， 2001)，可作為重要的生防資源加以開發(fā)利用。然而對蘋果病害具有生防作用的蘋果內(nèi)生細菌分離篩選的研究(尹寶重等， 2017)鮮有報道。本研究對新疆野蘋果內(nèi)生細菌進行分離和篩選，以期獲得對蘋果病害具有生防作用的菌株，可為蘋果病害生物防治提供新菌種資源和方法參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新疆野蘋果健康枝條采集于新疆伊利河谷鞏留縣交勒賽野果林，海拔1 325 m，地理坐標43.232°N，82.778°E。

蘋果病害病原菌： 葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和蘋果擬莖點霉(Phomopsismali)均由河南科技大學林學院林業(yè)生物技術(shù)實驗室分離保存。

內(nèi)生細菌分離培養(yǎng)基： NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基(方中達，1998)、LB培養(yǎng)基(蘇靜， 2007)、MEA培養(yǎng)基(徐濤， 2012)、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基(RBA)(王勇等， 2008)、水瓊脂培養(yǎng)基(WA)(王勇等， 2008)、MS培養(yǎng)基(Murashigeetal., 1962)、AT培養(yǎng)基(周婧， 2013)。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生細菌的分離與純化 取新疆野蘋果2年生枝條24枝，韌皮部和木質(zhì)部分別剪成5 mm×5 mm 左右的組織塊，75%的酒精消毒30 s，1%次氯酸鈉消毒3 min，無菌水漂洗3次后，組織塊(576塊)分別放置于各培養(yǎng)基表面； 同時，用稀釋分離法(組織塊320塊)分離內(nèi)生菌(方中達，1998)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中無光照培養(yǎng)，取最后一次漂洗的無菌水作為對照涂布于培養(yǎng)基表面，室內(nèi)連續(xù)觀察內(nèi)生細菌生長情況，適時挑取不同形態(tài)特征的菌落劃線于PDA培養(yǎng)基上，純化3次后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性測定 采用平板對峙試驗，篩選具有抑菌活性的內(nèi)生細菌。初次篩選： 在PDA平板中央放置病原菌菌餅(直徑7 mm)，將不同內(nèi)生細菌菌株距其2.5 cm處上下左右4個方向各劃1 cm長的菌線，每處理重復3次，未劃菌線的作為對照組。2～3天后，測量菌落直徑并計算抑菌率。抑菌率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。經(jīng)初次篩選獲得具有抑菌作用的菌株進行再次篩選。將菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)至OD值2.0(λ=600 nm)。在PDA培養(yǎng)基中央放置病原菌菌餅，菌餅上下左右4個方向放置濾紙片(直徑5 mm)，濾紙片距離菌餅2.5 cm，每個濾紙片滴加3 μL內(nèi)生細菌菌液，每處理重復3次，未放置濾紙的作為對照組。2～3天后，測量菌落直徑并計算抑菌率。

1.2.3 致病性測定 選擇健康的蘋果Maluspumila)紅富士品種2年生枝條，截成40 cm長的枝段，經(jīng)75%酒精表面消毒，無菌水沖洗3次，自然晾干后頂端用石蠟封頂。每個枝條作3處燙傷，將篩選出的內(nèi)生細菌菌株10 μL(108cfu·mL-1)滴于燙傷處。待菌液自然晾干后，用無菌濕潤的脫脂棉附在傷口處，保鮮膜包裹，下端插入自來水中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度不低于80%。傷口滴加10 μL無菌水作為陰性對照，傷口放置蘋果擬莖點霉菌餅的作為陽性對照。觀察接種部位發(fā)病情況，25天后統(tǒng)計枝條傷口發(fā)病數(shù)量，計算發(fā)病率，發(fā)病率=(發(fā)病傷口數(shù)/總的傷口數(shù))×100%。

1.2.4 菌株鑒定 1)形態(tài)學及生理生化鑒定 對篩選出的內(nèi)生細菌菌株進行形態(tài)學及生理生化鑒定，方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等， 2001)。

2) 16S rDNA基因序列測定 提取內(nèi)生細菌菌株基因組DNA后，對16S rDNA序列進行擴增，引物為16SL(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACCT-3′)和16SR(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，擴增程序為95 ℃預變性3 min； 98 ℃變性10 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共43個循環(huán)； 72 ℃延伸7 min。將擴增出的目的片段由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast相似性比對，下載同源性較高的相關(guān)菌株序列，使用Clustal X2進行多序列比對，用MEGA 4.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 試驗分析與統(tǒng)計方法 按照文中公式計算抑菌率，數(shù)據(jù)采用Spss 18.0軟件進行方差分析，Oneway ANOVA法進行顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆野蘋果枝干內(nèi)生細菌分離

用8種不同培養(yǎng)基從新疆野蘋果韌皮部和木質(zhì)部中共培養(yǎng)出內(nèi)生細菌217株。不同培養(yǎng)基和枝條不同組織分離得到的內(nèi)生細菌數(shù)量有所不同(表1)，從木質(zhì)部和韌皮部分離內(nèi)生細菌菌株數(shù)的比例約為2∶1。AT培養(yǎng)基上未分離到內(nèi)生細菌，孟加拉紅培養(yǎng)基未分離到韌皮部內(nèi)生細菌，其他培養(yǎng)基在韌皮部和木質(zhì)部均分離出內(nèi)生細菌。

表1 不同培養(yǎng)基和不同組織分離到的內(nèi)生細菌菌株數(shù)量

圖1 內(nèi)生細菌對3種蘋果病原菌抑菌效果

2.2 新疆野蘋果內(nèi)生細菌抑菌活性測定

2.2.1 拮抗菌株初次篩選 對217株內(nèi)生細菌進行平板對峙試驗，發(fā)現(xiàn)不同菌株對3種蘋果病原菌的抑菌效果不同。其中24株內(nèi)生細菌對葡萄座腔菌有拮抗作用，34株對膠孢炭疽菌有拮抗作用，45株對蘋果擬莖點霉有拮抗作用。選取對3種病原菌均有較高抑菌率的18株內(nèi)生細菌進行再次篩選，其中11株木質(zhì)部內(nèi)生細菌，7株韌皮部內(nèi)生細菌，菌株編號為L-m6、L-m12、L-m19、L-m23、P-m1、P-m7、P-m9、P-m11、P-r14、P-r16、P-r17、P-r21、M-m7、M-m12、M-m19、M-r12、M-r14和M-r16。

2.2.2 拮抗菌株再次篩選 平板對峙法檢測18株內(nèi)生細菌對3種蘋果病原菌的抑菌效果(圖1)。其中，14株內(nèi)生細菌對葡萄座腔菌抑菌率較高，10株抑菌率在60%～70%之間，4株抑菌率高于70%，最大抑菌率為77%。9株內(nèi)生細菌對膠孢炭疽菌具有明顯的抑制作用，抑菌率均大于55%，最大抑菌率為68.87%。18株內(nèi)生細菌均對蘋果擬莖點霉表現(xiàn)出較強抑制活性，抑菌率均高于60%，其中9株抑菌率在70%以上，最大抑菌率為79.22%。

圖2 7株高抑菌率內(nèi)生細菌對3種蘋果病原菌的拮抗作用

對抑菌率綜合分析，有7個菌株即M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、L-m12、P-r21對3種蘋果病原菌均具有明顯的抑菌效果(圖2)，對葡萄座腔菌的抑菌率分別為77.00%、72.60%、76.60%、60.64%、65.96%、65.81%、71.79%； 對膠孢炭疽菌的抑菌率分別為 69.85%、64.95%、68.87%、68.37%、56.12%、53.54%、65.66%； 對蘋果擬莖點霉的抑菌率分別為77.63%、79.22%、72.60%、69.37%、70.27%、69.30%和71.05%。

2.3 內(nèi)生細菌致病性測定

對上述7株內(nèi)生細菌進行致病性分析，陽性對照發(fā)病率為100%，陰性對照組和菌株M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、L-m12、P-r21發(fā)病率均為0，表明7株內(nèi)生細菌對蘋果枝條無致病性。

2.4 新疆野蘋果內(nèi)生細菌的鑒定

2.4.1 形態(tài)特征 菌株M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、L-m12、P-r21，在NA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)2天，觀察記錄菌落形態(tài)(表2)。7株內(nèi)生拮抗細菌，菌體均為桿狀，有芽孢，周生鞭毛。

表2 內(nèi)生細菌菌落特征

2.4.2 生理生化特征 7株內(nèi)生細菌的生理生化特征見表3。根據(jù)內(nèi)生細菌形態(tài)特征及生理生化特征(東秀珠等， 2001； Idrissetal., 2002； Clercketal., 2004； 楊可等， 2018)，初步鑒定菌株M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、L-m12、P-r21屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。M-m7、M-m12、P-m11、L-m12為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，M-r12、P-m9為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)，P-r21為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

2.4.3 菌株16SrDNA序列分析 菌株M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、P-r21、L-m12的16S rDNA擴增產(chǎn)物經(jīng)測序分別獲得大小為1 421、1 423、1 418、1 423、1 424、1 425、1 417 bp的序列。通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST同源進化分析，M-m7(16S rDNA收錄號： MK660023)、M-m12(16S rDNA收錄號： MK660029)與枯草芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： MH362700)相似性100%； M-r12(16S rDNA收錄號： MK660024)與貝萊斯芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： CP031880)相似性99%； P-m9(16S rDNA收錄號： MK660028)與貝萊斯芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： MH503854)相似性100%； P-m11(16S rDNA收錄號： MK660025)與枯草芽孢桿菌(B.subtilissubsp.subtilisstrain SML_M159)(16S rDNA收錄號： MG937689)相似性100%； P-r21(16S rDNA收錄號： MK660027)與解淀粉芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： CP031424)相似性100%； L-m12(16S rDNA收錄號： MK660026)與枯草芽孢桿菌(16S rDNA收錄號： JQ978219)相似性100%。

表3 內(nèi)生細菌生理生化特征①

①+: 陽性Positive； -: 陰性Negative； ND: 未做試驗Not tested.

結(jié)合細菌形態(tài)特征、生理生化特征，及16S rDNA序列分析結(jié)果，最終鑒定M-m7、M-m12、P-m11、L-m12為枯草芽孢桿菌，M-r12、P-m9為貝萊斯芽孢桿菌，P-r21為解淀粉芽孢桿菌。7株內(nèi)生菌均于河南科技大學林學院林業(yè)生物技術(shù)實驗室保存。

3 討論

目前，關(guān)于新疆野蘋果的研究多集中在種群、生態(tài)及遺傳特性方面(田潤煒等， 2016； 陳學森等， 2006； 吳傳金等， 2008； 馮濤等， 2006)，在其種子萌發(fā)特性(閆秀娜等， 2015)、繁育特性(秦偉等， 2010)、植株脅迫(徐彥等， 2010； 于瑋瑋等， 2016)和種質(zhì)資源(秦偉等， 2011)等方面取得了較多研究成果，而有關(guān)新疆野蘋果內(nèi)生菌的研究鮮有報道。李芳等(2015)為抑制新疆野蘋果組織培養(yǎng)時產(chǎn)生的內(nèi)生菌，曾分離鑒定了11株新疆野蘋果內(nèi)生真菌，未涉及篩選對植物病害具有拮抗作用的內(nèi)生細菌； 關(guān)于新疆野蘋果內(nèi)生細菌尤其具生防潛力的內(nèi)生細菌研究至今尚未見報道。本研究從新疆野蘋果枝條共分離出內(nèi)生細菌217株，篩選和鑒定出對3種蘋果病原菌均表現(xiàn)出較強抑菌作用的內(nèi)生細菌7株，這些內(nèi)生細菌菌株抑菌率高，且抗菌譜廣，對葡萄座腔菌、膠孢炭疽菌、蘋果擬莖點霉抑菌率分別在60%、53%、69%以上。

芽孢桿菌因可產(chǎn)生抗逆性的芽孢，性能穩(wěn)定，具有耐熱、抗旱、耐紫外線照射等特性，成為理想的生防菌篩選對象(彭兵等， 2011)。利用芽孢桿菌研制的生防制劑目前也已廣泛應用于植物病害的防治(李秀明， 2013)，如Pleban等(1995)利用內(nèi)生芽孢桿菌防治溫室蔬菜病害。本研究篩選出的7株內(nèi)生細菌均屬芽孢桿菌屬，且對蘋果樹上的3種病原菌均具有較強的抑菌作用，通過離體接種試驗證實對蘋果不具致病性，具有作為生防菌株防治蘋果病害的潛力。

許多內(nèi)生芽孢桿菌菌株不僅具有防病作用，而且具有促進植物生長等多種功能(Chungetal.， 2015； Romeroetal.， 2016)，本研究中篩選獲得的7株芽孢桿菌是否具有其他作用尚有待于進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從新疆野蘋果中分離篩選出對蘋果的3種病原菌具有較強抑制作用的優(yōu)良內(nèi)生細菌菌株7株，并根據(jù)形態(tài)學、生理生化特性和分子特征對它們進行了鑒定，M-m7、M-m12、P-m11、L-m12為枯草芽孢桿菌，M-r12、P-m9為貝萊斯芽孢桿菌，P-r21為解淀粉芽孢桿菌。經(jīng)平板對峙試驗證實這7株內(nèi)生細菌對蘋果樹病原菌葡萄座腔菌、膠孢炭疽菌、蘋果擬莖點霉均具有顯著的抑菌效果，并且無致病性。研究為蘋果病害的生物防治提供了菌種資源，為新疆野蘋果內(nèi)生菌的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。