楊佳駿 吳永波 張燕紅

(1.南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院 江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037)

近年來，高溫和干旱發(fā)生的頻率和強度日益增加，植物正常生長發(fā)育受到危害(Rossati， 2017)。葉片是植物光合作用的主要場所，是樹木發(fā)揮生態(tài)系統(tǒng)功能的基本單位(Wrightetal.， 2004)；葉片對環(huán)境脅迫敏感，其超微結(jié)構(gòu)的變化能反映植物對環(huán)境脅迫的響應(Xuetal.， 2006； Kratschetal.， 2000)。非生物脅迫對植物生長的影響有多種形式，會引起一系列形態(tài)和生理變化。木本植物在生長過程中經(jīng)常受高溫與干旱的復合脅迫(Luoetal.， 2008; Dai， 2013)。高溫、干旱脅迫對林木光合作用性能、葉綠素熒光參數(shù)、抗氧化特性以及活性氧代謝等方面的影響已有大量研究(吳永波等， 2016； 葉波等， 2014； 李黎等， 2017； 張燕紅等， 2017； Zandalinasetal., 2018)，而復合脅迫下木本植物超微結(jié)構(gòu)的變化卻鮮有報道。

楊樹(Populus)生長快、成材早、產(chǎn)量高,是我田中緯度平原地區(qū)種植面積最大的樹種之一，在解決我國木材資源短缺及生態(tài)環(huán)境治理方面具有重要地位(方升佐， 2008)，但極端高溫與干旱嚴重抑制楊樹的生長，從而影響其生態(tài)和經(jīng)濟效益(葉艷濤等， 2015)。目前，關(guān)于楊樹應對高溫與干旱脅迫的研究主要集中在生理特性、蛋白組學分析等方面(吳永波等， 2014)，而關(guān)于其超微結(jié)構(gòu)的變化研究卻鮮有報道。本文通過研究在高溫、干旱單一和復合脅迫下‘南林895楊’(Populus×euramericana‘Nanlin-895’)扦插苗生長以及葉片超微結(jié)構(gòu)的變化，從形態(tài)學和細胞學角度探討楊樹生長發(fā)育對高溫、干旱脅迫的響應機制，以期為楊樹在高溫、干旱地區(qū)的推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 試驗材料為‘南林895楊’扦插苗，穗長20～23 cm，徑粗2.0 cm。試驗用盆的內(nèi)徑為30.0 cm，高為20.7 cm。供試土壤為黃棕壤，pH5.96，有機質(zhì)含量15.14 g·kg-1，全氮含量0.83 g·kg-1，其中堿解氮含量15.79 mg·kg-1，全磷含量0.34 g·kg-1，其中有效磷含量1.34 mg·kg-1。在扦插3個月后將長勢良好的楊樹扦插苗放入3個不同溫度的FYS-8智能人工氣候室(3.5 m×2.5 m×3.0 m，高壓鈉燈光源，最大光合有效輻射為1 800 μmol·m-2s-1，最大光照度為80 000 lx，空氣相對濕度為60%)，白天溫度分別為25 ℃(適宜溫度T0)、35 ℃(中度高溫T1)、40 ℃(重度高溫T2)，夜間溫度均為25 ℃。設置3個水分梯度，土壤含水率分別為田間持水量的70%(適宜水分D0)、55%(中度干旱D1)、40%(重度干旱D2)，即有T0D0(對照)、T0D1、T0D2、T1D0、T1D1、T1D2、T2D0、T2D1、T2D2共9個處理。每個處理設4個重復，共36盆。試驗期間每天上午6：00，采用稱量與TR200水分測定儀相結(jié)合的方法，對每盆植物進行稱量并補充水分，確保土壤含水率在控制處理下。同時利用氣候室模擬自然環(huán)境，調(diào)節(jié)光照量，于每天6:00打開光照、18:00關(guān)閉光照。脅迫持續(xù)7周后，在第50天測定指標。

1.2 試驗方法 1) 形態(tài)指標測量 利用卷尺和游標卡尺分別測定扦插苗的株高、地徑。用自封袋自上而下收集各處理的楊樹苗生長完全展開的葉片5片，用掃描儀(Cano，Japan)進行掃描，將掃描圖片用ArcGIS軟件測量葉片的周長和面積，葉緣分裂程度=葉周長/葉面積。

2) 生物量測量 將不同處理下各4株楊樹扦插苗用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干，將根、莖、葉分開后分別置于信封袋中，放置于105 ℃烘箱中殺青15 min，75 ℃烘干至恒質(zhì)量，測定各部分生物量。生長指標：根莖比=地上生物量/地下生物量、葉分配指數(shù)=葉生物量/總生物量，莖分配指數(shù)=莖生物量/總生物量，根分配指數(shù)=根生物量/總生物量。

3) 葉片超微結(jié)構(gòu)觀察 分別取各處理的扦插苗完全展開的功能葉片(自上往下數(shù)第3片)，用刀片切得葉片中部大小1 mm×1 mm的葉片(不含葉脈)，迅速放入濃度為2.5%的戊二醛固定液中，用針筒抽去空氣使葉片沉入固定液(真空狀態(tài))，在戊二醛中固定24 h以上，用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液漂洗3次后，用 1%鋨酸在4 ℃下固定過夜，磷酸緩沖液漂洗； 再用乙醇系列脫水，丙酮過渡，Epon812樹脂滲透與包埋。LKB-V超薄切片機切片； 醋酸雙氧鈾以及檸檬酸鉛雙染； H-600型透射電鏡下觀察并照相。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 利用Microsoft office 2010進行數(shù)據(jù)處理分析； 采用SPSS 17.0進行方差分析，Duncan新復極差法進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫和干旱脅迫對‘南林895楊’扦插苗形態(tài)特征的影響 株高和地徑作為生長指標可直觀反映脅迫下的植株生長狀況。由表1可知，高溫、干旱單一和復合脅迫使株高和地徑均有不同程度下降，高溫脅迫下株高和地徑間差異顯著(P<0.05)，表現(xiàn)為T2D00.05)。復合脅迫對株高的影響顯著大于單一脅迫(P<0.05)，表現(xiàn)出復合脅迫對植物生長更強的抑制作用。與對照相比，T1D0、T2D0、T0D1、T0D2、T1D1、T1D2、T2D1和T2D2處理的株高分別下降6.1%、31.2%、20.3%、28.0%、29.1%、38.4%、40.3%和42.3%，地徑分別下降了3.7%、24.3%、22.4%、26.2%、30.0%、31.8%、28.0%和36.4%。

表1 高溫和干旱脅迫對‘南林895楊’幼苗生長的影響①

①同列數(shù)字后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。 下同。Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between treatments (P<0.05). The same below.

葉緣分裂程度因高溫、干旱單一和復合脅迫而增大。在高溫或干旱單因子脅迫下，葉緣分裂程度隨脅迫強度增加而增加，T1D0、T2D0、T0D1和T0D2分別比對照增加7.3%、49%、12.5%和33.5%，但僅T2D0處理與對照差異顯著(P<0.05)。T1D1、T1D2復合脅迫下的葉緣分裂程度顯著高于溫度單一脅迫處理(P<0.05)，分別較對照增加48%和38%。

2.2 高溫和干旱脅迫對‘南林895楊’扦插苗生物量分配特征的影響 由表2可知，隨單一和復合脅迫程度加劇，地上生物量、莖生物量、葉生物量均不同程度下降。高溫單因子脅迫下，各處理間的地上生物量、莖生物量差異顯著(P<0.05)； 干旱單因子脅迫下，各處理間無顯著差異(P>0.05)； 復合脅迫處理下，地上生物量、莖生物量、葉生物量均低于單一脅迫處理。

高溫、干旱單一和復合脅迫使根生物量下降。高溫脅迫下，各處理間差異顯著(P<0.05)，T1D0、T2D0處理分別較對照下降9.4%、39.4%，干旱脅迫下，T0D1、T0D2處理分別較對照下降12.7%、24.8%，其中T0D2處理與對照差異顯著(P<0.05)，復合脅迫T1D1、T2D1、T2D2處理下，根生物量均低于單因子脅迫處理，分別較對照下降17.2%、45.7%、47.4%。T1D2處理的根生物量高于T0D2單一脅迫處理，較對照下降15%(表2)。

高溫、干旱單一和復合脅迫下，隨著脅迫程度加劇，扦插苗總生物量下降顯著(P<0.05)。高溫脅迫處理間差異顯著(P<0.05)，T1D0、T2D0處理分別較對照下降13.6%、52.1%，其中T1D0處理與對照差異不顯著(P>0.05)； 干旱脅迫T0D1、T0D2處理的總生物量分別較對照下降24%、38.1%，與對照差異顯著(P<0.05)； 復合脅迫T1D1、T1D2、T2D1、T2D2處理下總生物量低于單一脅迫處理，分別較對照下降25.9%、35.7%、59.5%、63.0%(表2)。

高溫、干旱單一和復合脅迫下，楊樹幼苗根莖比升高。高溫脅迫T1D0、T2D0處理分別較對照升高6.4%、38%，兩者間差異顯著(P<0.05)； 干旱脅迫T0D1、T0D2處理分別較對照升高21%、27.9%，兩處理之間無顯著差異(P>0.05)，表明重度高溫脅迫對根莖比的影響大于干旱脅迫。中度高溫脅迫對根莖比無顯著影響(P>0.05)； 復合脅迫下根莖比上升幅度大于單一脅迫，T1D1、T1D2、T2D1、T2D2處理分別較對照升高13.9%、48.4%、48.4%、64.5%，但與單一脅迫差異不顯著(P>0.05)(表2)。

2.3 高溫和干旱脅迫對‘南林895楊’扦插苗葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響 1)正常條件下葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu) 正常溫度和水分條件下的扦插苗葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)如圖1。葉肉細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞內(nèi)含有中央大液泡，液泡膜光滑清晰(圖1A、B)。細胞核呈球形，核被膜清晰，染色質(zhì)均勻分布(圖1C)。葉綠體呈橢圓形或卵圓形，結(jié)構(gòu)完整，淀粉粒分布均勻(圖1D)。葉綠體基粒片層清晰、排列緊密未出現(xiàn)解體現(xiàn)象，葉綠體內(nèi)含有少量的嗜鋨體(圖1E)。

表2 高溫和干旱脅迫對楊樹苗器官生物量分配的影響

圖1 正常溫度和水分條件下的‘南林895’扦插苗葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)

圖2 高溫或干旱單一脅迫下‘南林895楊’扦插苗葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)

2) 高溫或干旱單一脅迫下葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的變化 中度高溫T1D0處理下，楊樹扦插苗葉肉細胞結(jié)構(gòu)正常，排列緊密，未發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖2A)。細胞核結(jié)構(gòu)完整，核膜清晰(圖2B)。葉綠體排列規(guī)則緊貼細胞壁，略有膨脹，但不明顯(圖2C)。淀粉粒含量未發(fā)生太大變化。葉綠體內(nèi)嗜鋨顆粒變大(圖2A、C)，基粒片層排列整齊稍有擴張(圖2D)。重度高溫T2D0處理下，細胞結(jié)構(gòu)正常，個別葉肉細胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離的現(xiàn)象(圖2E箭頭)。細胞核結(jié)構(gòu)正常，核膜清晰(圖2F)。葉綠體膨大變圓，部分發(fā)生消解。淀粉顆粒減少，嗜鋨體數(shù)量大量增加(圖2G)?；Ｆ瑢訑U張，出現(xiàn)空泡(圖2H)。中度干旱T0D1處理下，楊樹葉肉細胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊(圖2I)。細胞核核膜清晰(圖2J)。葉綠體結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量減少且有膨大變圓趨勢。淀粉粒含量減少，嗜鋨顆粒增多(圖2K)，片層出現(xiàn)擴張現(xiàn)象(圖2L)。重度干旱T0D2處理下，楊樹葉肉細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞形狀呈狹長型(圖2M)。核膜部分邊界模糊(圖2M)。葉綠體膨大變圓，位于細胞中間。淀粉顆粒減少(圖2O)，嗜鋨體變大，片層擴張明顯，部分消融(圖2P)。

高溫脅迫與干旱脅迫對楊樹葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響有許多異同點。超微結(jié)構(gòu)顯示，高溫脅迫對細胞器膜結(jié)構(gòu)的影響要比干旱脅迫顯著，而細胞形狀和葉綠體數(shù)量對干旱脅迫有明顯響應。

3) 高溫和干旱復合脅迫下葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的變化 T1D1處理下，細胞結(jié)構(gòu)完整。葉綠體數(shù)量較高溫脅迫減少，膜結(jié)構(gòu)部分消失(圖3A)。細胞壁外表面出現(xiàn)少量的黑色致密物質(zhì)(圖3B、C，箭頭)。核膜結(jié)構(gòu)不清晰(圖3B)。嗜鋨顆粒數(shù)量較單一脅迫增加(圖3C)，葉綠體片層擴張明顯(圖3D)。T1D2處理下，細胞質(zhì)壁分離嚴重，少量細胞形態(tài)扭曲(圖3E)，細胞壁外表面有少量黑色致密物質(zhì)(圖3F、G箭頭)，核膜消失，細胞核開始解體(圖3F)。葉綠體膨大變圓邊界模糊，淀粉粒消失，嗜鋨顆粒數(shù)量較單一脅迫明顯增加(圖3G)，葉綠體片層嚴重擴張，部分消融(圖3H)。T2D1處理下，葉肉細胞嚴重扭曲(圖3I)，葉綠體膨大變圓邊界模糊，質(zhì)壁分離現(xiàn)象嚴重(圖3I、J箭頭)。細胞核形狀不規(guī)則，核質(zhì)凝集(圖3K)。葉綠體膜結(jié)構(gòu)不清晰，有內(nèi)含物流出(圖3K)。淀粉顆粒較單一脅迫減少，嗜鋨顆粒較單一脅迫增大增多(圖3K、L)。葉綠體片層模糊，消融嚴重(圖3L)。T2D2處理下細胞結(jié)構(gòu)扭曲(圖3M)，細胞出現(xiàn)嚴重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖3M箭頭)。細胞內(nèi)膜系統(tǒng)大部消失。細胞核消融嚴重，胞質(zhì)外流(圖3N)。葉綠體數(shù)量減少，消融嚴重基質(zhì)外流(圖3M)。淀粉顆粒數(shù)量減少，嗜鋨顆粒增加(圖3O)。細胞壁外表面有黑色致密物質(zhì)(圖3O箭頭)，葉綠體片層擴張甚至扭曲，空泡化嚴重(圖3P)。

圖3 高溫和干旱復合脅迫對‘南林895楊’扦插苗葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

3.1 高溫和干旱脅迫對楊樹形態(tài)和生長的影響 高溫、干旱脅迫下的‘南林895楊’扦插苗的株高、地徑均呈下降趨勢，根、莖、葉的生長都受到抑制。雖然扦插苗對中度高溫干旱表現(xiàn)出一定抗性，但重度高溫干旱脅迫對扦插苗生長抑制較為明顯。復合脅迫對生長的危害更嚴重，在高溫條件下植物需要通過提高蒸騰來降低葉片溫度以維持其正常功能，同時要避免干旱條件下蒸騰過快加速土壤水分消耗。因此，復合脅迫下生長的幼苗需發(fā)育出大小適宜的葉片來平衡水分利用與葉表溫度。高溫環(huán)境中生長的植物多具有大的葉片，通過增大蒸發(fā)面積達到快速降低葉表溫度的目的，而干旱區(qū)的植物葉片偏小則是長期適應水分虧缺的結(jié)果。葉形在高溫干旱的條件下對葉表的降溫作用明顯，因為在干旱條件下蒸騰的降溫作用受到抑制，植物更多地依賴葉形改變來降低邊界層阻力從而增加葉片散熱(李永華等， 2018)。葉緣分裂程度(周長面積比)可作為葉片邊界層阻力的特征值(Roth-Nebelsick， 2001)。與對照相比，單因素脅迫和復合脅迫下的葉緣分裂程度均增加，說明在葉片變小過程中的周長降幅小于面積降幅。在干旱區(qū)，葉長的優(yōu)先變化有利于周長的變化，寬度的優(yōu)先變化有利于葉面積的變化(李永華等， 2012)，說明楊樹葉片在脅迫條件下趨向變窄。通過模擬葉片的熱成像可知，小而窄的葉片邊界層阻力小，因此溫度較低且降溫更快(李永華等， 2018)。葉形的變化也影響到植物生物量的分配策略，葉面積減小，降低植物對碳和能源的消耗，大部分同化產(chǎn)物被運輸?shù)礁浚龠M根系生長(Lincoln Taizetal.， 2015)，這與本研究根莖比增加的結(jié)果相一致，根莖比增加利于植物在表層土壤水匱乏的干旱條件下擴大根系吸水面積(閆海霞等， 2011； 井大煒等， 2014)。

3.2 高溫和干旱脅迫對楊樹葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響 從葉形態(tài)角度去討論植物對環(huán)境的生長策略，只是根據(jù)葉片生長狀態(tài)所做的推測，葉片形態(tài)性狀的改變主要是由物種遺傳特性所決定的(韓威等， 2014； 李東勝等， 2013)。在重度非生物環(huán)境因子脅迫下，植物的生長變化也有可能是生理過程受到干擾的表現(xiàn)。因此，通過電鏡圖像分析比較不同程度的脅迫對植物超微結(jié)構(gòu)的損傷，可以更準確地區(qū)分逆境條件下植物的適應與受迫狀態(tài)。干旱脅迫下植物細胞脫水，液泡變小，膨壓降低。膨壓驅(qū)動細胞伸展的過程對水分虧缺十分敏感，即使降幅很小，也可導致葉片生長緩慢，甚至完全停止生長。這與觀察到的重度干旱脅迫下葉肉細胞變窄變小的趨勢一致。同時觀察到水分虧缺時葉綠體數(shù)量減少，說明干旱脅迫下植物生長受抑可能是光合細胞器減少和膨壓共同作用的結(jié)果。與干旱相比，高溫對細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷更嚴重，在干旱脅迫下相對穩(wěn)定的葉綠體被膜在重度高溫時有消解的趨勢。在中度干旱脅迫下提高處理溫度，細胞發(fā)生嚴重的內(nèi)膜紊亂和胞質(zhì)外滲現(xiàn)象。內(nèi)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定是維持胞內(nèi)正常生理過程的必要條件。高溫可導致細胞膜損傷和酶失活，并通過改變?nèi)~綠體的膜特性和能量轉(zhuǎn)移機制的解偶聯(lián)影響光合速率(Lincoln Taizetal., 2015)。類囊體膜上的光系統(tǒng)Ⅱ?qū)囟葮O其敏感，是高溫抑制光合作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(郝召君等， 2017)。對類囊體垛疊與松散及其功能發(fā)揮的研究指出，H+的傳遞受2個光系統(tǒng)、電子遞體間距離及偶聯(lián)程度的限制(錢露萍等，1985)，片層的擴張會影響光反應的電子傳遞進而影響光合作用。

‘南林895楊’幼苗脅迫條件出現(xiàn)葉綠體內(nèi)嗜鋨顆粒增多和淀粉粒減少現(xiàn)象，這在不同物種也有類似情況(陳健輝等， 2011； Lianopoulouetal.， 2014)。嗜鋨顆粒作為一些特殊脂類分子合成與貯存的場所，與類囊體相偶聯(lián)，在脅迫時脂類分子可作為電子載體保護類囊體使其免受自由基傷害(Grigorovaetal.， 2012)。也有研究認為，嗜鋨顆粒是類囊體降解膜脂聚集的產(chǎn)物，反映了脅迫條件下葉綠體受害程度加劇(萬里強等， 2009； 杜克兵等， 2010； 周艷威等， 2018)，本研究隨脅迫程度增加，‘南林895楊’幼苗葉片嗜鋨顆粒明顯增多。逆境條件下植物的應激反應和代謝能力下降都會造成淀粉粒積累，而光合能力的降低會減少淀粉粒的數(shù)量(唐琪等， 2018； 汪貴斌等， 2008； 熊賢榮等， 2017； 郁慧等， 2011)。復合脅迫下細胞發(fā)生不同程度的皺縮，質(zhì)壁分離嚴重。細胞內(nèi)膜系統(tǒng)在重度脅迫下模糊甚至消失，胞質(zhì)外滲，對胞內(nèi)正常生理過程產(chǎn)生嚴重影響。在單一脅迫下較為穩(wěn)定的細胞核核仁消失，染色質(zhì)凝集。也有研究指出，復合脅迫與單一脅迫是2種完全不同的過程(Grigorovaetal.， 2012)，它對植物的影響也不是單一脅迫的簡單疊加。干旱條件下植物通過蒸騰減少高溫傷害的抗逆行為受到限制，單一脅迫下植物的適應機制在復合脅迫下可能失去原有效用。復合脅迫下‘南林895楊’生物量驟減，與超微結(jié)構(gòu)受迫程度一致，高溫、干旱的復合脅迫對植物的影響比單一脅迫更為嚴重。

4 結(jié)論

高溫干旱脅迫下的葉片超微結(jié)構(gòu)的損傷影響了‘南林895楊’扦插苗的光合作用和細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，正常的生理過程受到影響，并最終反映在生長形態(tài)的變化上?？傮w而言，無論是生理生長還是細胞結(jié)構(gòu)層面的結(jié)果均表明，復合脅迫對扦插苗的影響要大于單一脅迫。在本研究中，超微結(jié)構(gòu)的改變與扦插苗的生長指標表現(xiàn)出一致性，說明從形態(tài)和細胞學角度來揭示植物對于脅迫的響應機制是可行的。結(jié)合對生理生化指標，如抗氧化酶、光合參數(shù)的定量測定，可以更好地判斷植物在不同程度脅迫下的適應與受迫情況。