李帥，艾連中，張匯，宋子波，賴?guó)P羲*

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海，200093) 2(云南貓哆哩集團(tuán)食品有限責(zé)任公司，云南 玉溪, 653100)

果膠是一種酸性多糖，由超過(guò)65%的半乳糖醛酸組成，還含有一些中性糖以及少量的蛋白質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)。果膠按照其酯化度的不同分為高甲氧基果膠和低甲氧基果膠，自然界中絕大部分果實(shí)中存在的果膠都是高甲氧基果膠(即高脂果膠)[1]。目前國(guó)際上商品類(lèi)果膠主要來(lái)源于柑橘皮和蘋(píng)果渣。近年來(lái)也開(kāi)發(fā)出甜菜果膠、檸檬皮果膠等新來(lái)源果膠。百香果又名西番蓮，是我國(guó)主要的熱帶水果之一,果實(shí)由30%的果汁、50%～55%的果皮及5%～8%的種子組成[1-2]，果皮占比較大且含有豐富的果膠物質(zhì)，若將其加以利用，則可變廢為寶。

酸性乳飲料(acidified milk drink，AMD)是非常受歡迎的蛋白質(zhì)類(lèi)飲料之一，為了獲得更好的口感，其pH范圍一般控制在4.7左右，但乳液中的酪蛋白容易發(fā)生聚集和沉淀，影響自身的口感。因此，在生產(chǎn)過(guò)程中常利用穩(wěn)定劑抑制這種聚集沉淀。果膠為常見(jiàn)的乳品穩(wěn)定劑，可以與酪蛋白產(chǎn)生靜電相互作用和空間位阻效應(yīng)，從而有效地防止蛋白質(zhì)聚集沉淀以及乳清分離[3-5]。然而果膠親水性高、疏水性低對(duì)酸性乳飲料的穩(wěn)定效果有限，利用食品工業(yè)級(jí)的酯化衍生法來(lái)提高果膠分子的疏水性，有利于促進(jìn)果膠在酸性乳品飲料的穩(wěn)定效果。

本研究提取百香果果皮中的果膠(passion fruit pectin，PFP)，進(jìn)而制備含疏水性辛烯基琥珀酸酐(octenyl succinic anhydride，OSA)基團(tuán)的果膠衍生物，以市售的柑橘果膠(citrus pectin，CP)作為參考，探討3種果膠樣品的添加對(duì)酸性乳飲料酸化過(guò)程中的穩(wěn)定效果，確定較適宜的穩(wěn)定條件和果膠種類(lèi)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果果皮，云南貓哆哩集團(tuán)；柑橘果膠(JMJ-YM150-H),美國(guó)CPKelco公司；脫脂乳粉，上海恒天然有限公司；HCl、OSA、HNO3、苯酚、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(glucono-delta-lactone, GDL)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer, FITC)等試劑采購(gòu)于上海源葉生物技術(shù)有限公司；乙醇、NaOH等試劑,上海泰坦股份科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PL2002型分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；RRH-A1000高速多功能粉碎機(jī)，上海緣沃工貿(mào)有限公司；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA公司；冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司；SP-752冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；T25數(shù)顯型分散機(jī)，德國(guó)IKA公司；馬爾文zeta電位儀Nano ZS，英國(guó)馬爾文公司；173 plus多角度激光光散射粒徑分析儀，美國(guó)Brookhaven公司；Discovery HR-3流變儀，美國(guó)TA儀器公司；A1R型激光共聚焦顯微鏡，日本尼康公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 百香果果膠的提取與酯化度測(cè)定

將百香果果皮烘干，磨粉，過(guò)120目篩，稱(chēng)取粉末按料液比1∶20(g∶mL)加入去離子水，攪拌溶解，用1 mol/L HNO3調(diào)節(jié)pH為2.1，靜置30 min，85 ℃水浴加熱3 h得到粗提液。粗提液經(jīng)8 000 r/min離心15 min，得到上層提取液，蒸發(fā)濃縮至1/3～1/2體積，緩慢向濃縮液中加入2倍體積的95%乙醇(體積分?jǐn)?shù))，靜置1 h，8 000 r/min離心15 min得到下層沉淀，用無(wú)水乙醇脫水，攪拌細(xì)碎化，4層紗布過(guò)濾，沉淀物置于50 ℃真空干燥箱72 h得到粗提果膠。然后將粗提果膠復(fù)溶，用3倍體積95%乙醇醇沉，經(jīng)離心后再細(xì)碎化以及干燥，最終得到百香果果膠。

酯化度采用GUZEL等[6]的滴定法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 果膠分子修飾及取代度測(cè)定

根據(jù)ZHAO等[7]的方法，稱(chēng)取10 g PFP樣品，加入90 mL去離子水，60 ℃攪拌溶解2 h，用0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5，按照m(OSA)∶m(PFP)=1∶7的比例緩慢加入OSA，期間維持溶液pH在8.5附近，反應(yīng)1 h后，調(diào)節(jié)pH至6.0終止反應(yīng)，用截留量8 000～14 000 Da透析袋于4 ℃下透析48 h，濃縮后凍干得到果膠衍生物POSA。

取代度采用滴定法[8]。稱(chēng)取2 g POSA樣品溶解于25 mL含有體積分?jǐn)?shù)90%異丙醇配制的2.5 mol/L HCl中，離心過(guò)濾，殘留物用90%異丙醇洗滌3次，干燥去除多余的異丙醇，將產(chǎn)物溶解于300 mL去離子水中，加入幾滴酚酞，用0.1 mol/L NaOH進(jìn)行標(biāo)定，記錄NaOH消耗體積為V1，以PFP為空白組，得到NaOH消耗體積V0，按公式(1)計(jì)算取代度：

(1)

式中：V0,空白組NaOH消耗體積,mL；V1,樣品組NaOH消耗體積,mL；c,NaOH濃度,mol/L；m,樣品質(zhì)量, g。

1.3.3 酸化乳飲料制備

取脫脂乳粉配制100 g/L的脫脂乳，室溫?cái)嚢? h，靜置2 h，90 ℃加熱滅菌15 min，冷卻至室溫，分別移取50 mL于容器中，分別加入2 g/L的PFP、POSA或CP，攪拌溶解，乳液以8 000 r/min均質(zhì)2 min后分別加入0、5、10、14和16 g/L的GDL，40 ℃保溫4 h，使乳液pH分別達(dá)到6.5、5.48、4.68、4.25和4.1，4 ℃過(guò)夜，使用前400 r/min攪拌15 min，使樣品恢復(fù)至室溫。

1.3.4 ζ-電位測(cè)定

使用配備有4 mol/L He/Ne激光器的Malvern Zetasizer Nano ZS裝置在633 nm處進(jìn)行ζ-電位測(cè)定。測(cè)定前，樣品溶液用對(duì)應(yīng)pH值去離子水稀釋10倍。儀器參數(shù)設(shè)置為等待時(shí)間120 s，平衡時(shí)間180 s，在室溫下使用Zetasizer軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集與分析。

1.3.5 粒徑測(cè)定

使用173 plus多角度激光散射粒徑分析儀對(duì)樣品溶液的光散射特征進(jìn)行分析。測(cè)定前，樣品溶液用對(duì)應(yīng)pH值的去離子水稀釋10倍，過(guò)0.45 μm濾膜。儀器參數(shù)設(shè)置：測(cè)試角度90°；溫度25 ℃；平衡時(shí)間300 s；檢測(cè)時(shí)間120 s。

1.3.6 流變學(xué)測(cè)定

使用配備有Peltier溫度控制器和恒溫循環(huán)水浴裝置的Discovery HR-3流變儀和不銹鋼平板(直徑：40 mm;間隙：1 000 μm)進(jìn)行流變參數(shù)測(cè)試。為了避免干燥引起的誤差，采用蒸餾水密封蒸汽屏蔽。采用TRIOS軟件對(duì)樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。

靜態(tài)剪切流變測(cè)試：取1.5 mL樣品置于平板上，于溫度25 ℃下剪切速率在0.01～1 000 s-1范圍內(nèi)測(cè)試表觀黏度隨剪切速率的變化。

動(dòng)態(tài)黏彈性測(cè)試：在25 ℃，2%應(yīng)變下(線性黏彈區(qū)內(nèi))，測(cè)定其彈性模量(G′)和黏性模量(G″)，掃描范圍：0.1～100 rad/s。

1.3.7 微觀分析—激光共聚焦測(cè)定

用1 mg/mL FITC乙醇溶液對(duì)AMD中蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，F(xiàn)ITC終濃度為40 μg/mL。將染色好的AMD置于單凹片上，蓋上載玻片，使用配備有Ne/Ar激光器的激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍500～550 nm，放大倍數(shù)400倍。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠的提取與分析

由表1可以看出，百香果果膠的平均得率為10.59%，稍低于KULKARNI等[9]報(bào)道的果膠提取率，分子修飾之后的POSA果膠取代度為0.016。PFP和POSA果膠的酯化度平均為84.9%～87.6%，大于CP的76.8%，表明3種果膠都屬于高甲氧基果膠(酯化度>50%)。

表1 果膠樣品的得率、取代度與酯化度Table 1 Yields, degree of substitution, and degree ofesterification of pectin samples

2.2 三種果膠對(duì)酸化過(guò)程中ζ-電位的影響

由于果膠是酸性多糖，乳液中主要的蛋白質(zhì)酪蛋白也是帶電基團(tuán)，通過(guò)ζ-電位來(lái)表征分子之間的相互作用以及表面電荷密度，ζ-電位的絕對(duì)值越大說(shuō)明穩(wěn)定效果越好[10-11]。從圖1可以看出，當(dāng)未添加果膠的空白組AMD在pH 6.5到4.1，ζ-電位值的絕對(duì)值逐漸變小，并在酸性pH<4.5時(shí)由負(fù)轉(zhuǎn)正[11]，說(shuō)明體系在酸化過(guò)程逐漸失穩(wěn)。當(dāng)體系中加入PFP、POSA和CP時(shí)，在pH>5.5時(shí)對(duì)ζ-電位值沒(méi)有明顯影響，這可能是由于此時(shí)的pH值與果膠溶液本身的pH值相近所致，隨著體系pH降低至酪蛋白等電點(diǎn)(pI 4.7)附近，加入果膠的3個(gè)體系ζ-電位值增大，說(shuō)明果膠吸附在蛋白質(zhì)的表面，改變了表面電荷密度，與溶液中的陰離子多糖產(chǎn)生靜電排斥，阻止了大顆粒聚集物的形成。實(shí)驗(yàn)表明，3種果膠均具有穩(wěn)定效果，且在pH 4.7附近，PFP和POSA的穩(wěn)定效果優(yōu)于CP，在pH<4.7時(shí)，PFP和POSA乳體系的ζ-電位值增長(zhǎng)較快，說(shuō)明穩(wěn)定效果變差。

圖1 三種果膠對(duì)脫脂乳懸浮液酸化過(guò)程中ζ-電位的影響Fig.1 Effects of PFP, POSA and CP on ζ-potential duringacidification of skimmed milk dispersions

2.3 三種果膠對(duì)酸化過(guò)程中粒徑大小的影響

因果膠為酸性陰離子多糖，可吸附在脫脂乳中酪蛋白的表面，運(yùn)用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)量聚合物的有效粒徑，進(jìn)而評(píng)估分子間的相互作用[12-13]。由圖2可知，空白組AMD的有效粒徑在pH 6.5～4.68范圍內(nèi)逐漸增大，并在pH 4.68時(shí)達(dá)到最大值1 803 nm；當(dāng)pH繼續(xù)降低，有效粒徑降低。添加PFP的乳液在偏中性的條件下未發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)合，在酸化至pH 4.68附近時(shí)，相對(duì)于空白組，PFP組體系的粒徑較小，在pH<4.68時(shí)則明顯增大了體系的粒徑，說(shuō)明PFP在此范圍內(nèi)穩(wěn)定效果不佳，這一點(diǎn)與電位分析結(jié)果一致。而POSA從偏中性開(kāi)始與體系中蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，并在pH 4.68時(shí)明顯減小了體系粒徑，隨著pH進(jìn)一步降低，這種穩(wěn)定效果逐漸變差。商品果膠CP對(duì)抑制大顆粒形成的效果與PFP類(lèi)似，在pH<4.68的范圍內(nèi),POSA呈現(xiàn)更好的穩(wěn)定效果。綜上，分子修飾之后的果膠POSA有著更好的穩(wěn)定效果，但在酸化后期的穩(wěn)定效果較差。

圖2 三種果膠對(duì)脫脂乳懸浮液酸化過(guò)程中有效粒徑的影響Fig.2 Effect of PFP, POSA and CP on effective particlesize during acidification of skimmed milk dispersions

2.4 三種果膠對(duì)酸化過(guò)程中流變性質(zhì)的影響

流變性是研究物質(zhì)在力的作用下的流動(dòng)和變形，是果膠的重要屬性之一。當(dāng)果膠作為穩(wěn)定劑加入到乳飲料中，黏度是評(píng)價(jià)果膠效果的重要指標(biāo)[14-15]。圖3為PFP、POSA和CP對(duì)脫脂乳酸化過(guò)程中表觀黏度隨剪切速率變化的影響。

a-AMD;b-PFP-AMD;c-POSA-AMD;d-CP-AMD圖3 PFP、POSA和CP對(duì)脫脂乳懸浮液酸化過(guò)程中表觀黏度的影響Fig.3 Effects of PFP, POSA and CP on apparent viscosities of skimmed milk dispersions duringacidification as a function of shear rate

圖3-a中，未添加果膠的乳液在酸化過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的剪切稀化行為，其中在pH 4.68時(shí)剪切變稀更為明顯，且對(duì)應(yīng)的黏度也較低，這與體系失穩(wěn)有著必然的聯(lián)系[16]。而添加PFP、POSA和CP后，明顯抑制了乳液在酪蛋白等電點(diǎn)時(shí)的不穩(wěn)定性，宏觀表現(xiàn)為表觀黏度對(duì)剪切速率依賴性降低。其中修飾之后的果膠POSA有著更低的剪切速率依賴性，在LIU等[17]的研究中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象。而添加PFP和CP的乳液在pH 4.68時(shí)有著相對(duì)較高的黏度，這可能是因?yàn)镻FP和CP與乳液中蛋白質(zhì)顆粒之間有著更強(qiáng)的分子纏繞，使得分子間相對(duì)流動(dòng)減弱，表現(xiàn)為表觀黏度增大[18]。

為了模仿人體口腔環(huán)境，選取剪切速率為40 s-1的表觀黏度[19]作圖。從圖4可以看出，AMD組在pH 4.68時(shí)表觀黏度下降到最低，隨著酸化的進(jìn)行，表觀黏度有明顯的升高。3種果膠的加入明顯增加了乳液在pH 4.68時(shí)的表觀黏度，PFP在pH<4.68的范圍內(nèi)有很好的穩(wěn)定性，而POSA在pH>4.68時(shí)對(duì)乳液的表觀黏度的穩(wěn)定性較好，隨著pH的進(jìn)一步降低，乳液的表觀黏度明顯上升。CP在酸化開(kāi)始時(shí)顯著增加了體系的表觀黏度，在pH≤4.68的范圍，乳液的表觀黏度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。說(shuō)明PFP和CP在pH<4.68的范圍內(nèi)對(duì)乳液的表觀黏度有較好的穩(wěn)定性，分子修飾之后的果膠POSA在偏中性條件下對(duì)表觀黏度的穩(wěn)定效果較好。

圖4 脫脂乳-果膠系統(tǒng)在剪切速率40 s-1下的表觀黏度隨pH值的變化Fig.4 Changes in apparent viscosity at a shear rate of40 s-1 with pH value for skim milk-pectin systems

物質(zhì)的黏彈特性反映著溶液的凝膠性質(zhì)，同時(shí)與膠體的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用有著很大的關(guān)聯(lián)性。儲(chǔ)能模量(G′)代表能量貯存而可恢復(fù)的彈性性質(zhì)，損耗模量(G″)代表流體流動(dòng)的黏性性質(zhì)。從圖5可以看出，4種乳體系下的G′和G″均表現(xiàn)出頻率依賴性，在pH 4.68時(shí)，AMD、PFP-AMD和CP-AMD體系的G′15 rad/s的范圍G′>G″，表現(xiàn)出彈性特征。與空白組AMD相比較，PFP和POSA組增大了其在pH 4.25時(shí)的模量值，在高頻區(qū)表現(xiàn)出G′>G″的類(lèi)流體性質(zhì)，說(shuō)明PFP和POSA在pH<4.7時(shí)對(duì)體系的凝膠性質(zhì)有著很大的影響，而含CP的乳體系則表現(xiàn)出在偏中性的環(huán)境下有利于G′和G″值的提高，當(dāng)pH<4.7時(shí)有著相對(duì)較高的模量值，但與空白組AMD比較，這種數(shù)值變化較小。

綜合穩(wěn)態(tài)剪切黏度(圖3)和動(dòng)態(tài)黏彈性模量(圖5)的分析，可以看出CP對(duì)乳體系下的流變性質(zhì)影響較小，而PFP和POSA則增大了乳體系的抗剪切能力以及高頻區(qū)的凝膠性質(zhì)，這可能是由于PFP和POSA與乳液中蛋白質(zhì)的相互作用更強(qiáng)，分子之間的纏繞更為緊密，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)不易發(fā)生“滑動(dòng)”所致[21]。

a-AMD;b-PFP-AMD;c-POSA-AMD;d-CP-AMD圖5 三種果膠對(duì)脫脂乳懸浮液酸化過(guò)程中動(dòng)態(tài)黏彈性模量的影響Fig.5 Effects of PFP, POSA and CP on dynamic moduli during acidification of skimmed milk dispersions

2.5 三種果膠對(duì)酸化過(guò)程中的微觀結(jié)構(gòu)影響

通過(guò)對(duì)體系中蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記，在一定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下，用激光共聚焦顯微鏡觀察，可以更加直觀地反映果膠對(duì)乳體系的穩(wěn)定性作用。從圖6可以看出，空白組AMD可以清楚的看出大面積的聚集，且聚集體呈絮狀，較為厚實(shí)，這與JORDAN等[22]的研究結(jié)果一致。而添加PFP的乳體系表現(xiàn)為局部較為細(xì)小的聚集。分子修飾之后的果膠POSA呈現(xiàn)出分布均勻但較為分散的聚集體，這可能是由于OSA具有一定的疏水性質(zhì)[23-24]導(dǎo)致的。而商品果膠CP在pH 4.68時(shí)表現(xiàn)出局部的、松散絮狀的大顆粒聚集。因此，從微觀圖像看，PFP抑制乳體系中大顆粒聚集的效果要優(yōu)于POSA， 而POSA又稍優(yōu)于CP。

a-AMD；b-PFP-AMD；c-POSA-AMD；d-CP-AMD；標(biāo)尺為50 μm圖6 三種果膠對(duì)脫脂乳懸浮液在pH 4.68時(shí)的CLSM圖像Fig.6 CLSM images of skimmed milk dispersions with PFP,POSA and CP at pH 4.68

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定ζ-電位、粒徑、流變學(xué)特性以及微觀分析，研究了百香果果膠PFP，分子修飾后的果膠POSA以及商品類(lèi)柑橘果膠CP對(duì)脫脂乳酸化過(guò)程中的穩(wěn)定效果。PFP、POSA和CP在添加量為2.0 g/L下，均提高了脫脂乳體系在酪蛋白等電點(diǎn)pH 4.7附近的ζ-電位絕對(duì)值，降低了有效粒徑。但是隨著pH繼續(xù)下降，PFP和POSA體系下的穩(wěn)定效果變差。另一方面，PFP和POSA提高了脫脂乳體系在酸化過(guò)程的抗剪切能力，以及動(dòng)態(tài)黏彈模量(G′、G″)，改變體系的凝膠性質(zhì)。通過(guò)CLSM圖像分析可以看出PFP和POSA均具有較好的抑制乳液中聚集物的形成效果，具有發(fā)展成商品類(lèi)果膠的潛質(zhì)。