陳森怡，劉振民，焦晶凱，包怡，龐佳坤，黨慧杰

1(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436) 2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

干酪，又稱奶酪、芝士，通過向牛奶中加入發(fā)酵劑、凝乳酶使其凝結(jié)，并切割成1 cm×1 cm×1 cm小塊，瀝干乳清，灌模成型后包裝。不同類型的干酪因其發(fā)酵劑、成分、工藝等不同，而在感官和質(zhì)地結(jié)構(gòu)方面表現(xiàn)差異。新鮮干酪因質(zhì)地柔軟(有或沒有孔隙)，乳白色或淡黃色，輕微的酸味和淡淡的香味等特性而受到消費(fèi)者的喜愛[1]。

歐美國(guó)家對(duì)于干酪的研究要遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于中國(guó)[2]，近年來研究集中于在干酪生產(chǎn)中添加特色的乳酸菌，使其具備特色風(fēng)味[3-4]或者功能性[5]。在中國(guó)，干酪普遍存在于云南、新疆、西藏等地，很多學(xué)者從這些地區(qū)的干酪中篩選特色乳酸菌進(jìn)行性能的研究[6-7]，但對(duì)于乳酸菌回補(bǔ)在干酪產(chǎn)品中的應(yīng)用研究較少。

乳酸菌是一類可將碳水化合物發(fā)酵成乳酸的革蘭氏陽性、無運(yùn)動(dòng)性和無芽孢形成細(xì)菌[8]。乳酸菌是細(xì)菌中具有多樣性的菌群，包括桿狀細(xì)菌，如瑞士乳桿菌，以及球菌，如乳球菌、腸球菌等[9]。這些乳酸菌對(duì)于干酪的風(fēng)味、感官、質(zhì)地等貢獻(xiàn)重大[10]。通常單一乳酸菌菌株不能滿足干酪生產(chǎn)的需求，為了生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的干酪產(chǎn)品，一般將具有不同發(fā)酵性能和作用的菌株進(jìn)行組合，實(shí)現(xiàn)菌株之間性能上的取長(zhǎng)補(bǔ)短，盡可能滿足生產(chǎn)的需要[6]。根據(jù)前期對(duì)單菌株的發(fā)酵性能的確定，本文將7株單菌株復(fù)配成6組不同的組合菌株，以期篩選出具備工業(yè)化生產(chǎn)潛力的菌株組合。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)E11，C44、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)G12、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)D41、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)B1、腸球菌(Enterococcusfaecium)F22，N，來源于光明乳業(yè)股份有限公司國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫；CHOOZITMMA14發(fā)酵劑，Danisco公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

脫脂乳粉，新西蘭恒天然公司；凝乳酶，科漢森公司；生牛乳，光明乳業(yè)牧場(chǎng)。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋，日本 HIRAYAMA 公司；奶酪槽，英國(guó)Armfiled公司；高壓均質(zhì)機(jī)，丹麥 APV 公司；METTLER TOLEDO 320 pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；Brookfield-DVⅡ+黏度計(jì)，美國(guó)博勒飛公司；Mb45 水分測(cè)量?jī)x，美國(guó) Ohous 公司；5417R 離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf 公司；ARES-G2流變儀，美國(guó) TA 儀器；TA-Plus質(zhì)構(gòu)分析儀器，英國(guó)Stable Micro Systems公司；Color Flex EZ臺(tái)式色差儀，美國(guó)Hunter Lab公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化及組合

取少量?jī)龃婀艿木劢臃N于質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%無菌脫脂乳中，進(jìn)行活化，30 ℃培養(yǎng)16～18 h，按3%～5%的接種量重新接種于新鮮無菌脫脂乳培養(yǎng)基中，傳代2～3次。

1.2.2 組合菌株產(chǎn)酸性能

將已活化的單菌株按照表1中的比例進(jìn)行組合，放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔3 h取1次樣，測(cè)定其pH值，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)繪制發(fā)酵時(shí)間pH曲線。

表1 菌株組合以及組合比例Table 1 Combination of strain and ratio

1.2.3 組合菌株產(chǎn)黏性能

重復(fù)1.2.2的接種操作，待發(fā)酵乳產(chǎn)生凝乳后，取等量凝乳進(jìn)行表觀黏度測(cè)定，測(cè)定參數(shù)為：轉(zhuǎn)子LV 2、轉(zhuǎn)速64 r/min、測(cè)定時(shí)間為10 s，平行測(cè)定3次取其平均值。繪制黏度-菌株組合曲線，對(duì)比不同菌株組合黏度的大小。

1.2.4 發(fā)酵乳持水性測(cè)定

取1.2.3中等量發(fā)酵乳，在4 ℃、6 000 r/min下離心20 min，棄去上清液后立即稱重。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取其平均值。按公式(1)計(jì)算持水力：

(1)

式中：m1，離心后沉淀的質(zhì)量，g；m，樣品的質(zhì)量,g。

1.2.5 新鮮干酪的制作

1.2.6 新鮮干酪基本理化指標(biāo)的測(cè)定

添加CHOOZITTMMA14發(fā)酵劑發(fā)酵的產(chǎn)品作為對(duì)照組進(jìn)行以下特性對(duì)比。

水分含量測(cè)定：使用水分含量?jī)x測(cè)定。稱取干酪樣品3 g，采用STEP模式，初級(jí)階段180 ℃、7 min;第二階段150 ℃、6 min。

水分活度的測(cè)定：采用水分活度儀測(cè)定，測(cè)試溫度：室溫。

色度測(cè)定：采用臺(tái)式色差儀測(cè)定，依次用黑板和白板進(jìn)行初次校正，取相同樣品量裝入容器中進(jìn)行測(cè)定。

干酪得率(出品率)測(cè)定：為從每升生產(chǎn)的牛奶中獲得的干酪的鮮重(g/L)[11]。

1.2.7 新鮮干酪感官評(píng)價(jià)

取4 ℃儲(chǔ)存的樣品，召集10名有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的志愿者進(jìn)行如表2所示項(xiàng)的評(píng)價(jià)。

表2 干酪感官評(píng)價(jià)[6]Table 2 Sensory evaluation of cheeses

1.2.8 新鮮干酪質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

借助TA-Plus質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定。取樣品均勻涂抹于測(cè)試模具中，4 ℃下冷藏30 min，取出樣品5 min內(nèi)測(cè)試完畢，每個(gè)樣品平行測(cè)定5次取其平均值。測(cè)定參數(shù):模式RETURN TO START;下降速度1 mm/s;測(cè)試速度3 mm/s;回程速度10 mm/s;觸發(fā)力1 g;探頭類型HDP/SR。

1.2.9 新鮮干酪動(dòng)態(tài)流變的測(cè)定

1.2.9.1 振幅掃描-應(yīng)變值的確定

振幅掃描，可用于測(cè)定線性黏彈區(qū)以及對(duì)樣品分散度的評(píng)估。通過掃描點(diǎn)處曲線的擬合(振蕩波形)確定所采取的應(yīng)變值大小。根據(jù)ROSENBERG等[12]和TUNICK等[13]的方法進(jìn)行修改，干酪的流變使用 ARES-G2流變儀進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試的夾具類型為 50 mm 的不銹鋼圓形平板，平板與測(cè)試臺(tái)的距離設(shè)置為1 mm，溫度為 20 ℃，應(yīng)變掃描范圍為 0.01～10%，通過對(duì)數(shù)掃描確定恒定的振蕩應(yīng)變區(qū)為線性黏彈區(qū)。

1.2.9.2 振蕩頻率的掃描

振蕩頻率的掃描，可用于觀察隨振蕩角頻率的變化干酪特征值的變化情況。根據(jù)CERNIKOVA等[14]的方法進(jìn)行了部分修改。在20 ℃下，根據(jù)以上線性黏彈區(qū)所確定的應(yīng)變值為0.025%，Gap設(shè)置為1 mm，在 0.1～100 rad/s范圍內(nèi)進(jìn)行頻率掃描。繪制以掃描頻率的對(duì)數(shù)刻度為橫坐標(biāo)，損耗/黏性模量G″、貯能/彈性模量G′、復(fù)合黏度η*為縱坐標(biāo)的流動(dòng)曲線。

1.2.10 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，采用IBM SPSS 22軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素ANOVA分析(P<0.05)，并進(jìn)行了Waller-Duncan的多范圍檢驗(yàn)，用EXCEL進(jìn)行制圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸性能測(cè)定結(jié)果分析

產(chǎn)酸速率是篩選乳酸菌的重要指標(biāo)。pH值會(huì)影響礦物質(zhì)的溶解度、水分含量、蛋白質(zhì)水解的程度和模式及其相互作用，從而影響干酪的質(zhì)地[1]與感官。圖1為各組合產(chǎn)酸速率的情況。由曲線可看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值逐漸降低，18 h 后各組合的pH值降低趨勢(shì)逐漸趨于平緩，其中組合1、3、5在15 h時(shí)pH值達(dá)到4.6左右，且顯著高于單菌株作用時(shí)的pH值變化速率，達(dá)到復(fù)配的效果。但部分組合，如組合6，經(jīng)過復(fù)配后產(chǎn)酸速率未得到顯著提升，可能組合菌株內(nèi)部間存在一定的競(jìng)爭(zhēng)作用。6個(gè)組合產(chǎn)酸速率的排序?yàn)椋航M合1>組合5>組合3>組合4>組合2>組合6。

圖1 發(fā)酵過程中發(fā)酵乳的pH變化Fig.1 pH of fermented milk during fermentation

2.2 產(chǎn)黏性能測(cè)定結(jié)果分析

菌株的產(chǎn)黏特性是評(píng)價(jià)干酪用乳酸菌的一個(gè)重要的指標(biāo)。黏度的大小對(duì)干酪成品的質(zhì)地、感官特性有很大影響[15]。乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)與黏性的產(chǎn)生有關(guān)，并呈現(xiàn)一定的正相關(guān)[16]，且對(duì)干酪的產(chǎn)率以及質(zhì)地起到一定改善的效果[17]。由圖2可知，組合1、2、4、5的黏度處在(366±6.08)～(481±1.53)mPa·s，其中組合1的黏度值最大，其次是組合4、2、5，且3組之間無顯著性差異(P>0.05)；另外復(fù)配菌株的黏度顯著高于單菌株的(125±2)～(351±2.3)mPa·s；組合3和6的黏度與其他4組黏度呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，黏度較低。根據(jù)不同的產(chǎn)品特性要求可選擇不同的菌株組合使用。

圖2 各組合發(fā)酵乳黏度的對(duì)比Fig.2 Comparison of fermented milk viscosity注：不同小寫字母表示組間顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 持水性分析

在產(chǎn)品運(yùn)輸儲(chǔ)藏中，持水性決定了乳清析出的程度，在生產(chǎn)和貨架期間，若持水性差，產(chǎn)品凝膠結(jié)構(gòu)容易破碎而較易析出乳清，直接影響產(chǎn)品質(zhì)量和品質(zhì)。由圖3可知，組合6持水性最小，(31.64±1.24)%，這可能與發(fā)酵乳最小黏度值有關(guān)，與徐顯睿[6]提出觀點(diǎn)一致。組合1、2的持水性較高，其次是組合3、4、5，且3個(gè)組合間無顯著性差異(P>0.05)。為了干酪產(chǎn)品穩(wěn)定性的考慮，一般選擇持水性較好的菌株或菌株組合。

圖3 各組合發(fā)酵乳持水性的對(duì)比Fig.3 Comparison of water-holding capacity of fermented milk

2.4 干酪的基本理化數(shù)據(jù)分析

水分含量和水分活度是評(píng)價(jià)干酪在貯藏期間的穩(wěn)定性的重要依據(jù)，水分含量是干酪尤其是新鮮干酪貯藏的一個(gè)至關(guān)重要的特征，它與干酪的硬度有極大的相關(guān)性，直接決定了產(chǎn)品的質(zhì)地。水分含量較高的干酪，質(zhì)地較軟，但是儲(chǔ)存期較短。生產(chǎn)中根據(jù)產(chǎn)品類型的不同控制水分含量，以達(dá)到產(chǎn)品品質(zhì)的要求。由表3可知，干酪的水分含量基本維持在60%～70%之間，其中組合6的干酪水分含量最低，與除組合4外其他組呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，在硬度上

表3 不同菌株組合干酪基本指標(biāo)分析Table 3 Analysis of basic indicators of products with different strains

注：數(shù)字不同的上標(biāo)小寫字母表示組間的差異性(P<0.05)；L*值(亮度)，從黑色(-)到白色(+)的陰影；a*值(紅色)，從綠色(-)到紅色(+)的色調(diào)；b*值(黃色)，色調(diào)從藍(lán)色(-)到黃色(+)

可能表現(xiàn)出比其他組更大的硬度值，因而貯藏期較其他組長(zhǎng)。除組合4、6外，其他各組干酪的水分含量與對(duì)照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。

水分活度是控制食品腐敗的重要因素,水分活度越小的產(chǎn)品越穩(wěn)定，較少出現(xiàn)腐敗的現(xiàn)象。各組干酪的水分活度均在0.99左右，符合細(xì)菌生長(zhǎng)的水分活度的范圍。其中組合4的水分活度值最小0.986 9±0.000 2，對(duì)照組的水分活度值最高0.997 2±0.001 1，與其他組干酪呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。其中組合2、3、5之間的水分活度差異較小，組合4、6之間無顯著性差異(P>0.05)。

開發(fā)新產(chǎn)品時(shí)，視覺呈現(xiàn)對(duì)于消費(fèi)者的接受度而言至關(guān)重要。光度值(L*)從大到小說明干酪光度值在不斷減小，a*從大到小說明綠度值在不斷增加，而紅度值在減小，b*從大到小說明黃度值在不斷減小，藍(lán)度值在增加[18]。從表3可以看出，組合1、4的干酪L*位于前2名，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；組合2、3、5干酪的L*與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)。組合5綠度值a*為-0.87，黃度值b*為8.65，都顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，組合1次之，a*-0.76，b*8.14；組合3的a*與對(duì)照組無顯著性差異，但b*顯著高于對(duì)照組。組合6光度值與其他組合及對(duì)照組相比，都呈現(xiàn)較顯著差異(P<0.05)，光度值處于最低水平，且a*、b*都與其他組相差甚遠(yuǎn)，處于低視覺水平。

干酪得率是在相同質(zhì)量原材料下，可獲取的產(chǎn)品質(zhì)量的多少，它在產(chǎn)品評(píng)估中是重要指標(biāo)之一。從表3可知，組合2的得率最大為31.42%，組合6處于最低水平20.65%；組合1、2、5得率分別高于對(duì)照組0.87%、2.3%、0.25%，組合3、4低于對(duì)照組1.6%、0.95%。其中組合6除在色澤方面表現(xiàn)較差外，得率也處于最低水平，該結(jié)果為感官、質(zhì)地的測(cè)定提供了信息基礎(chǔ)。

2.5 感官分析

由表4可知，組合1與對(duì)照組相比，除組織狀態(tài)外，外觀、色澤、滋氣味、紋理均無顯著性差異(P<0.05),且組合1的組織狀態(tài)評(píng)分高于對(duì)照組。組合6的滋氣味處于較高水平，但在其他方面均表現(xiàn)較差。從總分來看，與對(duì)照組相比，組合1、2、3的感官評(píng)分較高，可為產(chǎn)品篩選提供基本參考。

表4 不同菌株組合干酪感官評(píng)分Table 4 The sensory rating of products with different strains

注：同一行不同小寫字母表示組間顯著差異(P<0.05)

2.6 干酪質(zhì)構(gòu)分析

質(zhì)地是食品感官接受性的重要屬性，已有研究表明干酪的水分含量會(huì)影響其質(zhì)地特征。干酪樣品較低的水分含量顯示較高的抗變形能力，同時(shí)呈現(xiàn)較高的硬度，而較高的水分含量在組織狀態(tài)上以及儲(chǔ)藏上也存在弊端，即使水分含量的微小變化也會(huì)對(duì)新鮮奶酪的質(zhì)地產(chǎn)生重大影響[19-21]。從表5可以看出，水分含量較低的組合6，顯示較高的硬度值，對(duì)于新鮮干酪而言，質(zhì)地可能不滿足要求，不予考慮后續(xù)流變測(cè)定分析。組合1、2、3在硬度以及涂抹性上無顯著性差異(P<0.05)，略高于對(duì)照組；組合5和對(duì)照組之間在硬度以及涂抹性方面無顯著差異(P<0.05)。從數(shù)據(jù)分析看，組合1、2、3在硬度以及涂抹性方面接近對(duì)照組。

表5 不同組合菌株干酪質(zhì)構(gòu)分析對(duì)比Table 5 Comparison of texture of different strains

注：同一列不同小寫字母表示組間顯著差異(P<0.05)

2.7 干酪流變分析

流變學(xué)可以簡(jiǎn)單地定義為物體在受到應(yīng)力或應(yīng)變時(shí)的變形和流動(dòng)。干酪的流變特性是干酪在相應(yīng)的壓力或應(yīng)變條件下的響應(yīng)特性，例如在壓縮，剪切或切割過程中所表現(xiàn)的特性。在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下施加相應(yīng)的應(yīng)力或應(yīng)變，并對(duì)測(cè)得的流變學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行彈性、黏性定量分析[22]，其中G′代表儲(chǔ)能/彈性模量，G″代表損耗/黏性模量。如圖4所示,隨著0.1～100 rad/s角頻率的動(dòng)態(tài)掃描下，G′、G″隨著角頻率的增加而增加；復(fù)合黏度η*在0.1～1 rad/s頻率下呈現(xiàn)迅速下降的趨勢(shì)，在1～100 rad/s區(qū)間內(nèi)逐漸趨于穩(wěn)定。tanδ(G″/G′)可用于解釋干酪的流變行為，當(dāng)tanδ>0,1干酪表現(xiàn)為弱凝膠，當(dāng)tanδ<0.1時(shí)為彈性凝膠[23]。根據(jù)G″/G′計(jì)算知tanδ為0.2～0.3，故隨著掃描頻率的增加，G′和G″始終未出現(xiàn)任何相交點(diǎn)，所有干酪G′的值都顯著高于G″，且η*呈逐漸下降趨勢(shì)，tanδ>0.1，因此所有干酪呈現(xiàn)出弱凝膠性質(zhì)。

綜合圖4-a、圖4-b所示，組合干酪相對(duì)于對(duì)照組在黏彈性上有很大的提升，但是黏彈性要處于適中水平，滿足新鮮干酪軟質(zhì)的特性，組合4的G′、G″均處于最高水平，這與質(zhì)構(gòu)分析中組合4較高的硬度相呼應(yīng)，驗(yàn)證了水分含量對(duì)于干酪的硬度、涂抹性、黏彈性的重大的影響。各組合G′和G″在各掃描頻率下的排序如下：組合4>組合5>組合3>組合1>組合2>對(duì)照組。

3 結(jié)論

通過對(duì)6個(gè)組合菌株在脫脂發(fā)酵乳中基本特性的研究發(fā)現(xiàn),組合1產(chǎn)酸、產(chǎn)黏性能、持水特均表現(xiàn)較優(yōu)異;對(duì)其色澤、感官、質(zhì)地、流變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用發(fā)酵特性優(yōu)異的組合1的新鮮干酪各方面均優(yōu)于對(duì)照組，有開發(fā)使用潛力；組合2在發(fā)酵性能以及產(chǎn)品品質(zhì)方面均略低于組合1；組合3在產(chǎn)酸方面具有優(yōu)勢(shì)，但是持水性以及干酪產(chǎn)率較低；組合4在發(fā)酵性能、色澤感官方面均低于組合1。綜上分析，組合1菌株可用于新鮮干酪的開發(fā)使用，組合2可以考慮應(yīng)用。

a-儲(chǔ)能/彈性模量G′；b-損耗/黏性模型G″;c-復(fù)合黏度η*圖4 不同組合的新鮮干酪在20 ℃下的儲(chǔ)能/彈性模量G′(a)、損耗/黏性模量G″(b)和復(fù)合黏度η*(c)Fig.4 Storage/elastic modulus G′(a), loss/viscosity modulus G″(b)and composite viscosity η*(c) of fresh cheese atdifferent strain combinations