劉璐，艾連中，夏永軍，熊智強(qiáng)，管彤，宋馨

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

乳酸菌因發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)生大量乳酸而得名，是一類(lèi)不產(chǎn)孢子，過(guò)氧化氫酶促反應(yīng)為陰性，培養(yǎng)條件為厭氧或兼性厭氧的原核微生物[1-3]。部分乳酸菌通過(guò)產(chǎn)生乳酸、醋酸、苯乳酸、細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物而顯示出抗菌活性，可抑制致病菌和腐敗菌的繁殖，防止食品發(fā)生腐敗變質(zhì)，通常被用作食品的天然生物防腐劑[4-5]，在乳制品、泡菜等發(fā)酵食品中有著悠久的應(yīng)用歷史。

乳酸乳球菌是乳酸菌屬中重要成員之一，由于基因組相對(duì)較小，在基因工程及代謝方面已成為理想的模式菌株[6]、微生物細(xì)胞工廠[7]、口服疫苗傳遞載體[8]、異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主[9]。近年來(lái)，利用分子生物學(xué)手段可以在乳酸乳球菌中過(guò)表達(dá)外源基因，賦予宿主新的生物特性。在乳酸菌的表達(dá)系統(tǒng)中，外源蛋白的表達(dá)離不開(kāi)啟動(dòng)子的調(diào)控。啟動(dòng)子是基因表達(dá)重要的調(diào)控元件，決定了基因表達(dá)的強(qiáng)度和時(shí)機(jī)，啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，決定了蛋白質(zhì)表達(dá)量的多少[10]。啟動(dòng)子根據(jù)作用方式分為不同的類(lèi)型：一種是不受調(diào)節(jié)因子或生長(zhǎng)條件限制，可持續(xù)表達(dá)的組成型啟動(dòng)子；一種是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境進(jìn)行基因表達(dá)，需要添加誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[7]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，人工合成啟動(dòng)子的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)代謝工程更精細(xì)的調(diào)控且有助于基因低水平的表達(dá)[11]。

本文以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein，eGFP)基因?yàn)閳?bào)告基因，將人工合成啟動(dòng)子P11、組成型啟動(dòng)子P23、P32、P44分別克隆至報(bào)告質(zhì)粒中，利用電轉(zhuǎn)化得到攜帶目標(biāo)質(zhì)粒的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接著利用酶標(biāo)儀對(duì)各啟動(dòng)子調(diào)控的eGFP進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度的定量分析，以此表征各啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，從中篩選出乳酸乳球菌中具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

本文所用菌株、質(zhì)粒見(jiàn)表1。LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基用于大腸桿菌(Escherichiacoli)的培養(yǎng)，配方(g/L)如下：胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、NaCl 10、瓊脂粉15。乳酸乳球菌的培養(yǎng)基為GM17培養(yǎng)基，配方( g/L)：胰蛋白胨 5、大豆蛋白胨5、牛肉膏5、酵母浸出粉2.5、β-磷酸甘油二鈉19、MgSO4·7H2O 0.25、葡萄糖5、瓊脂粉(Agar)15。上述培養(yǎng)基若為液體培養(yǎng)基，則不加瓊脂粉。篩選標(biāo)記為紅霉素(erythromycin)，大腸桿菌工作質(zhì)量濃度為300 μg/mL；乳酸乳球菌工作質(zhì)量濃度為10 μg/mL。復(fù)蘇培養(yǎng)基：含2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的GM17液體培養(yǎng)基。20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)：2.432 g Tris溶于1 L滅菌去離子水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.2 主要試劑及儀器

PCR高保真酶PrimeSTAR HS(Premix)、Premix TaqTM、限制性?xún)?nèi)切酶PstI、BamHI、ApaI、EcoRI、BglII及T4DNA Polymerase、T4DNA Ligase、DNA Marker，Takara寶生物工程(大連)有限公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司；KOD FX Neo，日本Toyobo公司；割膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒，Axygen公司；紅霉素、瓊脂糖、Tris，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑，國(guó)藥集團(tuán)，分析純。利用Vector NTI設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

注：下劃線代表酶切位點(diǎn)

S1000TMThermal Cycler PCR儀、Powerpac basic凝膠電泳儀、凝膠成像儀、MicroPulser電擊轉(zhuǎn)化儀、2 mm電轉(zhuǎn)杯，美國(guó)Bio-Rad公司；超微量核酸蛋白定量?jī)xNanodrop 2000/2000c，Thermo Fisher Scientific公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；Spectra Maxi3x酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞的制備

(1)取凍藏于-80 ℃冰箱的甘油管E.coliTop10劃線于LB固體平板，37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12～16 h，單菌落狀態(tài)直徑為1～2 mm。

(2)挑取單菌落，接種至裝有4 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃下200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12～16 h。

(3)以1%的接種量接種至裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于37 ℃下200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.3～0.5。轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，冰上靜置10 min。于4 ℃下4 500 r/min離心10 min，收集菌體，棄上清液。

(4)用預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重懸洗滌細(xì)胞2次，4 ℃下4 500 r/min離心2～5 min，收集菌體，棄上清液。重懸于預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2-10%甘油溶液中。每100 μL感受態(tài)細(xì)胞分裝于預(yù)冷的1.5 mL EP管中，凍藏于-80 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以pMG36e、pNZ44質(zhì)粒為模板，P32-F/R，P44-F/R為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得啟動(dòng)子片段P32、P44。以pLpCas9-0537、pIB184-eGFP為模板，pIB184-P11-F、P11-eGFP-R，eGFP-P11-F、eGFP-R為引物，分別擴(kuò)增獲得片段P11、eGFP。再以片段P11、eGFP為模板，pIB184-P11-F、eGFP-R為引物進(jìn)行overlap PCR，獲得片段eGFP-P11。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s(PCR擴(kuò)增用高保真酶PrimeSTAR HS；若PCR驗(yàn)證用Premix TaqTM，退火時(shí)間為30 s)，72 ℃延伸1 min/kb；變性至延伸循環(huán)30次，72 ℃總延伸10 min。

用PstI/BamHI、ApaI/EcoRI分別雙酶切pIB184-eGFP骨架，將酶切后的DNA片段進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收6 565、5 880 bp片段，獲得線性化載體；啟動(dòng)子片段P32、P44，eGFP-P11分別與PstI/BamHI、ApaI/EcoRI雙酶切后的線性化載體骨架經(jīng)Clon Express II One Step Cloning Kit無(wú)縫克隆連接，以構(gòu)建帶有不同啟動(dòng)子的質(zhì)粒。

經(jīng)PstI/BamHI雙酶切線性化載體pIB184-eGFP，70 ℃金屬浴5 min，使限制性?xún)?nèi)切酶失活，冷卻至室溫后加入dNTPs、T4DNA Polymerase，37 ℃保溫40～60 min，割膠回收，T4DNA Ligase連接，16 ℃金屬浴4～5 h，以構(gòu)建不含啟動(dòng)子的空載對(duì)照。

將以上連接產(chǎn)物及對(duì)照分別轉(zhuǎn)化至100 μLE.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，冰上靜置30 min，42 ℃水浴45～90 s，冰浴2～5 min后加入37 ℃預(yù)熱的900 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃下200 r/min搖床復(fù)蘇1 h，涂布于含有紅霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng) 12～24 h。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，分別用引物P32-F/R，P44-F/R，pIB184-P11-F、eGFP-R，pIB184-eGFP-F/R驗(yàn)證pLL06、pLL07、pLL37、pLL15。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子接種于液體LB+Em培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃下200 r/min搖床培養(yǎng)12～16 h，按照Axygen公司質(zhì)粒DNA提取試劑盒中說(shuō)明書(shū)抽提質(zhì)粒，進(jìn)一步酶切驗(yàn)證。挑選酶切片段正確的質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。以上質(zhì)粒分別命名為pLL06(攜帶P32啟動(dòng)子)、pLL07(攜帶P44啟動(dòng)子)、pLL37(攜帶P11啟動(dòng)子)、pLL15(無(wú)啟動(dòng)子)。

1.3.3 乳酸乳球菌的轉(zhuǎn)化

將pLL06、pLL07、pLL37、pLL15及pIB184-eGFP分別電轉(zhuǎn)至乳酸乳球菌NZ9000感受態(tài)細(xì)胞中，每100 μL細(xì)胞中轉(zhuǎn)化200 ng左右的質(zhì)粒，感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，復(fù)蘇后涂布于含有紅霉素的GM17固體平板，30 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h后挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，分別用引物P32-F、pIB184-eGFP-R，P44-F、pIB184-eGFP-R，pIB184-P11-F、eGFP-R，pIB184-eGFP-F/R驗(yàn)證pLL06、pLL07、pLL37、pLL15。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為L(zhǎng).lactisNZ9000-pLL06、L.lactisNZ9000-pLL07、L.lactisNZ9000-pLL37、L.lactisNZ9000-pLL15、L.lactisNZ9000-pIB184-eGFP。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s(KOD FX Neo)，68 ℃延伸30 s/kb；變性至延伸循環(huán)30次，68 ℃總延伸10 min。

1.3.4 熒光強(qiáng)度的測(cè)定

將L.lactisNZ9000-pLL06、L.lactisNZ9000-pLL07、L.lactisNZ9000-pLL37、L.lactisNZ9000-pLL15、L.lactisNZ9000-pIB184-eGFP分別劃線活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至GM17+Em液體培養(yǎng)基中。30 ℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，1.5 mL菌液于12 000×g下離心1 min，棄上清液；20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)洗滌2次后重懸菌體，混勻后每個(gè)樣品取100 μL加入96孔板。在激發(fā)波長(zhǎng)480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm下，用酶標(biāo)儀測(cè)eGFP的表達(dá)強(qiáng)度及OD600值。每個(gè)樣品3個(gè)平行測(cè)定[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因片段的擴(kuò)增

分別以pMG36e、pNZ44為模板，引物P32-F/R、P44-F/R擴(kuò)增啟動(dòng)子P32、P44，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖1所示。

M-DL 500 DNA Marker; 1～3-啟動(dòng)子P32; 4～6-啟動(dòng)子P44圖1 PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子P32、P44Fig.1 PCR amplified the promter of P32, P44

泳道1～6在近300 bp處有特異性清晰條帶，與啟動(dòng)子P32、P44片段大小287、288 bp相符。以pLpCas9-0537、pIB184-eGFP為模板，引物pIB184-P11-F、P11-eGFP-R，eGFP-P11-F、eGFP-R分別擴(kuò)增片段P11、eGFP。如圖2所示，泳道1～3是P11的PCR條帶93 bp(圖2-a)。在750 bp處有明亮的條帶，與eGFP片段772 bp的大小相符(圖2-b)。片段P11及eGFP經(jīng)overlap PCR后在瓊脂糖凝膠1 000和750 bp間有單一條帶，與819 bp的eGFP-P11片段大小相符(圖2-c)。

a-M-DL 500 DNA Marker, 1～3-PCR擴(kuò)增P11;b-M-DL 2000 DNAMarker, PCR擴(kuò)增eGFP;c-M-DL 2000 DNA Marker,1～3-overlap擴(kuò)增eGFP-P11圖2 PCR擴(kuò)增P11、eGFP、eGFP-P11Fig.2 PCR amplified the fragment P11, eGFP and eGFP-P11

2.2 酶切載體的獲得

用PstI/BamHI、ApaI/EcoRI分別雙酶切質(zhì)粒pIB184-eGFP，將線性化的DNA片段6 565、5 880 bp進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖3。如圖3-a所示，1～2為質(zhì)粒pIB184-eGFP經(jīng)PstI/BamHI雙酶切出6 565、239 bp(圖中未顯示)的條帶。圖3-b中，1為質(zhì)粒pIB184-eGFP經(jīng)ApaI/EcoRI雙酶切出5 880、924 bp的條帶。

a-M-DL 15000 DNA Marker, Pst I/BamH I酶切pIB184-eGFP;b-M-DL 10000 DNA Marker, Apa I/EcoR I酶切pIB184-eGFP圖3 雙酶切載體pIB184-eGFPFig.3 Double enzyme digested the vector pIB184-eGFP

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

分別挑取pLL06、pLL07、pLL37、pLL15轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。如圖4-a所示，泳道1～2為pLL07的插入片段P44的驗(yàn)證結(jié)果，泳道3～4為pLL06的插入片段P32的驗(yàn)證結(jié)果。圖4-b是pLL37的插入片段eGFP-P11驗(yàn)證結(jié)果，均與預(yù)期片段大小相符。挑菌落PCR驗(yàn)證正確的單菌落，轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)后收集菌體提質(zhì)粒，進(jìn)一步進(jìn)行酶切驗(yàn)證。如圖5-a所示，泳道1為pLL06經(jīng)PstI/BglII雙酶切，獲得5 816、1000 bp的條帶；泳道2為pLL07經(jīng)PstI/EcoRI雙酶切，獲得5 827、990 bp的條帶；泳道3為pLL37經(jīng)ApaI/EcoRI雙酶切，獲得5 880、773 bp的條帶。圖5-b中，泳道1為EcoRI單酶切pLL15，片段大小為6 551 bp；泳道2為對(duì)照質(zhì)粒pIB184-eGFP經(jīng)EcoRI單酶切，片段大小為6 804 bp。酶切出的片段大小均與預(yù)期相符，說(shuō)明pLL06、pLL07、pLL15、pLL37系列質(zhì)粒構(gòu)建成功。

a-M-DL 500 DNA Marker; 1～2-pLL07; 3～4-pLL06;b-M-DL 1000 DNA Marker; 1～4-pLL37圖4 PCR驗(yàn)證pLL06、pLL07、pLL37Fig.4 PCR verified pLL06, pLL07 and pLL37

M-DL 10000 DNA Marker; a-1-pLL06; 2-pLL07; 3-pLL37;b-1-pLL15; 2-對(duì)照pIB184-eGFP圖5 酶切驗(yàn)證不同啟動(dòng)子的質(zhì)粒Fig.5 Identification of plasmids of different promotersby enzyme digestion

2.4 熒光強(qiáng)度的測(cè)定

將重組質(zhì)粒pLL06、pLL07、pLL37、pIB184-eGFP及pLL15電轉(zhuǎn)至乳酸乳球菌NZ9000感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。如圖6-a所示，泳道1～3為pLL15用引物pIB184-eGFP-F/R進(jìn)行驗(yàn)證，片段大小為863 bp；泳道4～6為pLL07用引物P44-F、pIB184-eGFP-R進(jìn)行驗(yàn)證，片段大小為993 bp；泳道7～8為pLL06用引物P32-F、pIB184-eGFP-R進(jìn)行驗(yàn)證，片段大小為992 bp。如圖6-b所示，pLL37用引物pIB184-P11-F、eGFP-R進(jìn)行驗(yàn)證，片段大小為819 bp。結(jié)果顯示所有重組質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ9000中。挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)量對(duì)數(shù)期不同啟動(dòng)子調(diào)控eGFP的表達(dá)強(qiáng)度，如圖7所示。結(jié)果表明，啟動(dòng)子P11的活力十分微弱，啟動(dòng)子P23、P32、P44分別比P11高約23.9、7.8、4.1倍。

a-M-DL 2000 DNA Marker; 1～3-pLL15; 4～6-pLL07;7～8-pLL06;b-M-DL 1000 DNA Marker; 1～2-pLL37圖6 PCR驗(yàn)證NZ9000-pLL06、pLL07、pLL15、pLL37Fig.6 PCR verified NZ9000-pLL06, pLL07, pLL15and pLL37

圖7 利用基于eGFP的報(bào)告系統(tǒng)對(duì)不同啟動(dòng)子強(qiáng)度的測(cè)定Fig.7 Evaluation of the transcriptional activities of differentpromoters via an eGFP reporting system注：圖中不同字母表示存在極顯著性差異(P<0.01)

3 結(jié)果與討論

在乳酸乳球菌中，蛋白質(zhì)的表達(dá)可通過(guò)組成型啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控使基因持續(xù)性表達(dá)，也可通過(guò)誘導(dǎo)型系統(tǒng)添加誘導(dǎo)肽誘導(dǎo)相應(yīng)啟動(dòng)子發(fā)揮活性以調(diào)控相應(yīng)蛋白的表達(dá)，如Nisin-controlled expression system[14]，Sugar-inducible expression system[15]。誘導(dǎo)型系統(tǒng)可以降低毒性蛋白產(chǎn)生的毒性，避免細(xì)胞死亡，但系統(tǒng)的表達(dá)需要添加誘導(dǎo)肽，不易調(diào)控，操作繁瑣。pIB184是廣宿主大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒，常用做乳酸菌過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體[16-17]。為篩選出易于調(diào)控、適用于乳酸乳球菌、啟動(dòng)強(qiáng)度高的啟動(dòng)子，本研究以eGFP為報(bào)告基因、pIB184質(zhì)粒為骨架，建立了乳酸乳球菌NZ9000報(bào)告系統(tǒng)。通過(guò)無(wú)縫克隆的方式，獲得一系列攜帶不同啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，并將其分別轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌中。利用酶標(biāo)儀測(cè)定eGFP的表達(dá)強(qiáng)度，比較啟動(dòng)子P11、P23、P32、P44在乳酸乳球菌NZ9000中調(diào)控基因表達(dá)能力的強(qiáng)弱。結(jié)果表明啟動(dòng)子P11轉(zhuǎn)錄活性較弱，這可能是由于乳酸菌對(duì)啟動(dòng)子具有嚴(yán)格的宿主選擇性[18-19]。啟動(dòng)子P23轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)，這與VOSSEN等[20]在乳脂鏈球菌中的研究結(jié)果一致。宋馨[13]在干酪乳桿菌中對(duì)P23與Pcas、PJ23119、Pldh進(jìn)行了比較，結(jié)果表明P23調(diào)控eGFP表達(dá)的能力最強(qiáng)。因此，推斷P23是目前應(yīng)用在乳酸菌中轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)的啟動(dòng)子。本研究建立了乳酸乳球菌適用的報(bào)告系統(tǒng)，可被應(yīng)用于篩選不同轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。同時(shí)利用該系統(tǒng)，鑒定了不同啟動(dòng)子在乳酸乳球菌中的轉(zhuǎn)錄活性，獲得了不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子，為外源基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。