狄雪琪，高聰聰，張純 ，孫文博，梁文芳，姚孟輝，王倩倩，鄭朝暉

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南鄭州 450052）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種多因素自身免疫性疾病，其發(fā)病機制尚未明確。研究顯示SLE患者的血液系統(tǒng)有異常高的RNA編輯水平，一些會影響蛋白質(zhì)翻譯并可能產(chǎn)生新的自身抗原［1］。RNA腺苷脫氨酶（adenosine deamina ses acting on RNA，ADAR）是能將RNA中腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤盏腁至I編輯酶。ADAR1是第一個被識別且表達(dá)最廣泛，是哺乳動物中有編輯酶活性的脫氨酶之一。近期發(fā)現(xiàn)ADAR1基因突變與多種自身免疫性疾病有關(guān)，如Aicardi－Goutières綜合征某些表型與 SLE相似，患者I型干擾素（IFN）升高，其嚴(yán)重的自身免疫表現(xiàn)強調(diào)了ADAR1在維持體內(nèi)免疫平衡方面的重要性［2］。Vlachogiannis等［3］明確所有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織及活動性患者血液中ADAR1升高，經(jīng)治療改善后ADAR1下降。研究者在HeLa和MCF7細(xì)胞體外實驗發(fā)現(xiàn)，IFN－α水平改變可調(diào)節(jié)ADAR1表達(dá)，而在SLE患者中，血清I型IFN升高（主要是IFN－α）并參與發(fā)病［4］。鑒于尚無探討 SLE中 IFN－α與ADAR1相關(guān)性的研究，本研究旨在明確 SLE患者PBMCs中ADAR1與血清IFN－α的相關(guān)性及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1—8月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院治療的30例SLE患者，均為漢族女性，符合1982年美國風(fēng)濕病學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)［5］對SLE的分類。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、皮肌炎等；（2）合并病毒感染、腫瘤、器官移植；（3）懷孕或哺乳期。另外有30名健康女性（體檢信息未顯示明顯異常）志愿參與這項研究（對照組）。收集患者及對照組的年齡、發(fā)病時間等人口統(tǒng)計學(xué)信息，及患者的血尿常規(guī)、抗體檢測結(jié)果等實驗室檢查數(shù)據(jù)，評估其臨床癥狀并計算SLE活動指數(shù) （SLE disease activity index，SLEDAI）［6］。此研究方案已獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審查編號2019－KY－187）。所有患者均提供書面知情同意書。

1.2 PBMCs提取收集SLE患者和對照組清晨空腹外周靜脈血20 mL，置于 EDTA抗凝管中，采用Ficoll－Hypaque（Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden）密度梯度離心法分離 PBMCs，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌并經(jīng)紅細(xì)胞裂解液 （Solarbio，Beijing，China）裂解紅細(xì)胞后，置于－80℃冷凍保存用于后續(xù)實驗。

1.3 RNA提取和qRT－PCR實驗采用 TRIzol（Servicebio，Wuhan，China）法提取 PBMCs的總 RNA后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，用 NanoDrop 2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，Shanghai，China）檢測 OD260nm／OD280nm的比值，對大于1 8～2 0的樣品用 RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒（Thermo Fisher Scientific，Shanghai，China）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。另外，通過定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcriptase polymerase chain re action，qRT－PCR）來測量靶基因mRNA的相對水平。ADAR1的引物序列為 5’－TGTGGGTGGCCTTTTG GAGT－3’（正 向）和 5’ －ACCAGCGAC CCCCAACTTTT－3’（反 向）（Servicebio，Wuhan，China）。所有實驗均重復(fù)3次。擴增人ACTIN cDNA作為內(nèi)參對照。

1.4 血清IFN－α水平檢測收集SLE患者和對照組清晨空腹外周靜脈血5 mL，置于干燥的紅頭普通采血管中，低速離心獲得血清后，按照制造商的說明，使用人IFN－α試劑盒（CUSABIO，Wuhan，China）通過酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清 IFN－α水平。檢測范圍為12 5～800 0 pg·mL－1。

1.5 統(tǒng)計分析采用 SPSS 21 0（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）統(tǒng)計軟件，進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Standard Deviation，SD）表示，不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)和四分位數(shù)表示，組間比較采用 Mann－Whitney U檢驗，采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料描述30例SLE患者均為女性，年齡為20～55歲，平均（32 93±4 97）歲，病程分布為30 00（2 00，99 00）個月，其中非活動期 6例，中度活動期12例，重度活動期12例，腎臟受累13例，24 h尿總蛋白（24 h UTP）為2 45（0 24，7 40）g，血液系統(tǒng)受累13例，關(guān)節(jié)受累12例。對照組年齡為24～52歲，平均（30 52±3 15）歲，其性別、年齡、種族與 SLE組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0 05）。

2.2 血清IFN－α和PBMCs中ADAR1的表達(dá)量及兩者相關(guān)性分析SLE組PBMCs中ADAR1表達(dá)量［0 73（0 27，1 54）］高于對照組［0 44（0 25，0 69）］（P＜0 05）（圖1A），SLE組血清 IFN－α水平［82 06（46 44，177 63）pg· mL－1］高 于 對 照 組 ［0 00（0 00，4 62）pg·mL－1］（P＜0 01）（圖 1B）。分析發(fā)現(xiàn)在30例SLE患者中有25例IFN－α水平＜260 0 pg·mL－1，當(dāng)血清 IFN－α水平 ＜260 0 pg·mL－1時，PBMCs中ADAR1的表達(dá)水平與血清IFN－α水平呈正相關(guān)（P＝0 046，r＝0 402，n＝25）（圖1C）。

圖1 血清IFN－α和PBMCs中ADAR1的表達(dá)量及兩者的相關(guān)性分析

2.3 SLE患者血清IFN－α和PBMCs中ADAR1表達(dá)水平與疾病活動度的相關(guān)性分析SLE組PBMCs中ADAR1表達(dá)水平與SLEDAI和24 h UTP呈正相關(guān)，而與C3和C4無相關(guān)性。SLE組血清IFN－α水平與SLEDAI呈正相關(guān)，與C3呈負(fù)相關(guān)，而與C4和24 h UTP無相關(guān)性。見表1。

表1 SLE組血清IFN－α和PBMCs中ADAR1表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

Laxminarayana等［7］提出SLE中較高的ADAR1水平可增加T細(xì)胞中的病理性RNA編輯，A至I RNA編輯是SLE中誘發(fā)基因突變的新機制。這是一種遺傳信息修飾機制，是基因調(diào)控在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生的另一重要事件，可催化轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物 RNA前體（pre－RNA）中特定部位的腺苷轉(zhuǎn)變成肌苷，從而產(chǎn)生新的遺傳密碼，是蛋白質(zhì)分子多樣性發(fā)生的重要機制之一［8］。SLE患者整體編輯活動升高是炎癥狀態(tài)的一種表現(xiàn)，導(dǎo)致編輯的蛋白質(zhì)種類增多、水平升高［9］。它們有可能被加工成自身抗原表位，之后可能被呈遞至主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子上，從而刺激自身免疫反應(yīng)［1］，進(jìn)而可能加重SLE患者的病情，臨床上可表現(xiàn)為靶器官受損加重、SLEDAI評分增高等。本研究發(fā)現(xiàn)SLE組PBMCs中ADAR1表達(dá)水平高于對照組，這與Laxminarayana等［7］的研究結(jié)果一致。此外，實驗中發(fā)現(xiàn) SLE組PBMCs中ADAR1表達(dá)水平與SLEDAI呈正相關(guān)。因此，隨著將來繼續(xù)擴大樣本量與完善實驗，檢測SLE患者PBMCs中ADAR1表達(dá)水平或可能和經(jīng)典的抗dsDNA抗體發(fā)揮相似作用，成為一個評估SLE疾病活動度的潛在生物標(biāo)志物。

SLE患者血清有較高水平的IFN－α，并在體內(nèi)引起多種免疫反應(yīng)。B細(xì)胞、T細(xì)胞和粒細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)具有較高的I型IFN誘導(dǎo)基因［10］。IFN－α可通過調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞的分化、激活和功能來影響免疫系統(tǒng)，從而促進(jìn)SLE的發(fā)?。?1］。本研究顯示 SLE組血清IFN－α水平高于對照組，且與SLEDAI呈正相關(guān)，與C3呈負(fù)相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)與Oke等［4］的研究結(jié)果一致。Fritzell等［12］分別在Hela和MCF7兩種體外細(xì)胞系中由低到高加入不同濃度的 IFN－α，最高濃度達(dá)200 U·mL－1，結(jié)果顯示，隨著加入IFN－α濃度的升高，兩種細(xì)胞系均顯示A至I的編輯率升高，ADAR1的表達(dá)量升高，說明在此濃度內(nèi)的IFN－α可以最大程度的誘導(dǎo)編輯，而超過200 U·mL－1的IFN－α并不能繼續(xù)誘導(dǎo)升高ADAR1的表達(dá)。我們的實驗證實SLE組 PBMCs中ADAR1的表達(dá)與一定范圍內(nèi)血清IFN－α水平呈正相關(guān)?？赡艽嬖趦煞N原因：第一，在此范圍內(nèi)的血清IFN－α可以最大程度地誘導(dǎo)編輯，以濃度依賴性增加ADAR1的表達(dá)，但Fritzell等［12］并未在其研究中明確這種誘導(dǎo)升高的機制；第二，ADAR1已被證實是IFN反應(yīng)（包括IFN產(chǎn)生和IFN信號傳導(dǎo)）的關(guān)鍵抑制因子，它保護(hù)細(xì)胞免受過度激活的IFN信號傳導(dǎo)產(chǎn)生的有害影響［13］，在SLE患者中有較高水平的IFN－α和IFN信號傳導(dǎo)，ADAR1作為IFN反應(yīng)的抑制因子，或可能是為抑制高水平的IFN相關(guān)反應(yīng)而反饋性增加，進(jìn)而可在一定程度內(nèi)控制高水平的IFN－α，引起SLE患者病情加重。此外，研究發(fā)現(xiàn)血清IFN－α為260 pg·mL－1是一個分界點，當(dāng)IFN－α超過此濃度時ADAR1表達(dá)水平開始呈下降趨勢，但在本實驗中僅有5例患者IFN－α濃度高于260 pg·mL－1，無法行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南嚓P(guān)性分析。Li等［14］在HEK293T細(xì)胞體外實驗中證實高濃度的IFN－α可以劑量依賴性誘導(dǎo)ADAR1表達(dá)量下降，并認(rèn)為IFN－α是通過促進(jìn) ADAR1泛素化導(dǎo)致其降解。因此，ADAR1在SLE患者中是否存在這種降解機制值得進(jìn)一步研究。

本研究明確了ADAR1和血清IFN－α在SLE患者中的異常表達(dá)，并分析其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)SLE患者PBMCs中ADAR1表達(dá)水平與血清IFN－α的相關(guān)性，提出ADAR1或可成為一個評估SLE疾病活動度的潛在生物標(biāo)志物，且SLE患者中異常表達(dá)的IFN－α可能參與調(diào)節(jié)PBMCs中ADAR1的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索SLE發(fā)病機制提供了新線索，并為靶向藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。