蔡 麗，董耀榮，李文濤，劉 毅

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院(上海 200071)

卒中后抑郁(Post-stroke depression,PSD)是與腦卒中事件相關(guān)、臨床表現(xiàn)為抑郁心境的情感障礙性疾病。屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”、“郁證”范疇，屬于“因病致郁”兩者合病而成。目前很多研究者認(rèn)為該病由于臟腑功能失調(diào)，或氣血不足，在內(nèi)傷積損的基礎(chǔ)上，復(fù)因外邪、情志、飲食等而誘發(fā)，導(dǎo)致氣血運行不暢，氣滯痰阻，瘀血內(nèi)生，痰熱內(nèi)蘊，或肝陽化風(fēng)、血隨氣逆，導(dǎo)致腦脈痹阻或血溢脈外而發(fā)中風(fēng)。中風(fēng)后氣血逆亂，上沖于腦，加之情志不舒，肝氣郁滯，痰瘀互阻而致郁。多項臨床研究表明中醫(yī)藥治療PSD，包括中藥治療、中成藥等治療手段，可以因人因時因地辨證論治，個體化的治療方案針對性強，除了可以改善患者抑郁癥狀外，還可以改善患者的中醫(yī)其他癥候，療效明確，副作用較小，有一定優(yōu)勢。前期研究證實神經(jīng)復(fù)元方對改善卒中后抑郁患者抑郁癥狀有較好療效[1-2]，但對其發(fā)揮作用的分子機制尚無研究。有研究發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic facto，BDNF)水平與PSD具有相關(guān)性[3-4]。本實驗引入BDNF/TrkB通路抑制劑(K252a)，探討神經(jīng)復(fù)元方是否通過介導(dǎo)BDNF-TrkB信號通路發(fā)揮抗抑郁作用，為本方分子機制打下一定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材 料

1.1 動物：清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，3個月齡，體重(210±30)g，上海實驗動物研究中心提供，在標(biāo)準(zhǔn)實驗環(huán)境中飼養(yǎng)。出生1 d的SD新生鼠，由上海實驗動物研究中心提供。所有實驗操作經(jīng)上海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并指導(dǎo)進行，盡量減輕動物的痛苦。

1.2 主要實驗用試劑：神經(jīng)復(fù)元方藥劑，采用單味中藥配方顆粒沖調(diào)而成，由江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供、MEM培養(yǎng)基、BDNF 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、木瓜蛋白酶溶液、脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)、BCA蛋白濃度測定試劑盒及RIPA裂解液、電泳液、麗春紅、脫脂奶粉、轉(zhuǎn)膜液、氯仿、異丙醇等。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備：制備大鼠正常血清和神經(jīng)復(fù)元方含藥血清。選取SD大鼠12只，隨機分為正常對照組和神經(jīng)復(fù)元方組，各6只。神經(jīng)復(fù)元方組每次按照1 ml/100 g的神經(jīng)復(fù)元方灌胃，每日兩次，連灌7 d，第7天給藥后2 h腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，離心，分離血清，滅活(紫外線消毒法)、抽濾、凍存。

2.2 原代大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)：選取新生1 d的SD大鼠，從胎鼠中分離出全腦。使用兩對精細鑷子在立體顯微鏡下從大腦中解剖大約20個海馬，小心地從海馬體中移除腦膜。將所有胎鼠和組織保持在最小必需培養(yǎng)基(Minimal essential medium，MEM)中并在冰上冷卻。除孵育和離心外的所有后續(xù)步驟均在層流罩中進行。解剖后，將海馬用7～8 ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)在15 ml錐形管中輕輕洗滌3次。洗滌后，將5 ml木瓜蛋白酶溶液和20～60 μl脫氧核糖核酸酶I(DNase I)加入到管中海馬中，然后將其在32℃下孵育12 min。孵育并用酶消化后，使用巴斯德玻璃吸管緩慢吸移海馬12次，然后用濕潤細胞過濾器(40-μmmesh，BD Biosciences)過濾到50 ml錐形管中。預(yù)先將細胞過濾器用10 ml含有20%FBS和1%N2補充物(100×,Invitrogen,Life technologies)的MEM潤濕，以防止非特異性神經(jīng)元細胞附著。將整個海馬懸浮液倒入細胞過濾器中，然后將10 ml，20%FBS/N2/MEM倒在上面以收集殘留在過濾器上的神經(jīng)元。輕輕搖動總體積25 ml的混合液使酶失活，放置1 min，然后以180×g離心10 min。接下來，吸出上清液，將沉淀物以3×104個細胞/ml的恒定細胞密度重懸于培養(yǎng)基中。隨后，將細胞懸浮液以每孔1 ml的體積接種到12孔板孔中。每個孔預(yù)先用0.5 ml的25% PuraMatrix制備，輕輕地進行電鍍。以這種方式制備的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元放置在37℃以下，含5%，CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后以無血清培養(yǎng)基全量換液，此后每3 d換液1/3。3 d后加濃度為5×10-6mmol/L的阿糖胞昔，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖。將大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)到第7天，經(jīng)NSE染色鑒定純度。

2.3 藥物血清毒性試驗及最佳濃度：設(shè)空白對照組(正常血清)和不同濃度的中藥血清組，將各組中藥血清分別按2.5%、5%、7.5%、10%、15%的血清濃度和正常培養(yǎng)基相混合，與原代海馬神經(jīng)元細胞進行培養(yǎng)，每組4皿，分別于24 h、72 h后收集細胞，采用MTT法觀察不同濃度藥物血清對原代海馬神經(jīng)元細胞增殖的影響，以確定無毒劑量及最佳含藥血清濃度。

2.4 細胞分組及干預(yù)：海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)第7天，進行實驗分組。正常對照組：在培養(yǎng)液中孵育3 h后，更換含空白血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。H2O2培養(yǎng)組：在培養(yǎng)液中孵育3 h后，更換100 μmol/L，H2O2培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。含藥血清(Serum)+ H2O2培養(yǎng)組：含藥血清預(yù)處理1 h，再加入100 μmol/L ，H2O2培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。含藥血清(Serum)+K252a+ H2O2組：含藥血清預(yù)處理1 h，再加入BDNF/TrkB通路抑制劑K252a(K252a又分為100、200、400 nmol/L ，3個劑量)及100 μmol/L H2O2培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。K252a+ H2O2組：含藥血清預(yù)處理1 h，再加入BDNF/TrkB通路抑制劑K252a(K252a又分為100、200、400 nmol/L 3個劑量)及100μmol/L， H2O2培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。每組5個復(fù)孔，收集細胞進行檢測。K252a為BDNF/TrkB信號通路抑制劑；H2O2濃度為100 μmol/L。

2.5 透射電鏡觀察：用透射電鏡測量海馬神經(jīng)元突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括突觸界面曲率、突觸活性區(qū)長度與突觸后致密物厚度、突觸間隙寬度[5]。

2.6 實時熒光定量PCR檢測：采用實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測突觸生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)、突觸蛋白(SYN I和SYNA)的mRNA基因表達水平。主要步驟參考文獻[6]，分為Total RNA的提取和鑒定、cDNA合成和定量PCR反應(yīng)，最后經(jīng)過上機擴增檢測，利用2-ΔΔct法計算。

2.7 Western-Blot檢測：采用Western-Blot實驗進行蛋白質(zhì)印跡分析，測定海馬神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白SYN I、SYNA和突觸生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)的表達水平。主要實驗步驟參考文獻[6]。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料用t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1 透射電鏡觀察結(jié)果 與對照組比較，H2O2組的突觸密度降低，提示H2O2引發(fā)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)損傷海馬神經(jīng)元；H2O2加入含藥血清(Serum)組突觸密度增大，突觸后致密物厚度增厚(H2O2+Serum組)，提示神經(jīng)復(fù)元方可以有效修復(fù)H2O2對神經(jīng)元的損傷作用；當(dāng)同時加入含藥血清和BDNF/TrkB信號通路阻斷劑K252a后，神經(jīng)元突觸密度降低，突觸后致密物厚度變薄，神經(jīng)元損傷修復(fù)效果減弱(H2O2+K252a+Serum組)，提示K252a阻斷BDNF/TrkB信號通路起到效果(圖1)。

2 實時熒光定量檢測 檢測各組對突觸相關(guān)蛋白SYNA、GAP-43和SYN1的mRNA表達影響(圖2)。H2O2組、K252a+ H2O2組、含藥血清+ K252a+ H2O2組的SYNA、GAP-43和SYN1 mRNA水平低于對照組和含藥血清+ H2O2培養(yǎng)組(P<0.01)。與對照組比較，含藥血清+H2O2培養(yǎng)組三項mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示，H2O2可損傷突觸相關(guān)蛋白基因作用，加入神經(jīng)復(fù)元方的血清可以有效修復(fù)這種損傷，若加入K252a阻斷了BDNF/TrKB信號傳導(dǎo)通路則藥物作用受到抑制。

圖1 培養(yǎng)細胞神經(jīng)元TEM超微結(jié)構(gòu)(×10000)

圖2 各組SYNA、GAP-43、SYNI的mRNA表達水平比較(★P<0.05，★★P<0.01)

3 蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果 定量測定和比較海馬神經(jīng)元中突觸相關(guān)蛋白SYNA、GAP-43和SYN I的表達水平，結(jié)果見圖3、4。H2O2組、K252a+H2O2組、含藥血清+ K252a+ H2O2組的SYNA、GAP-43及SYN I蛋白表達水平明顯低于對照組和含藥血清+H2O2組(P<0.01)；與對照組比較，含藥血清+H2O2培養(yǎng)組突觸相關(guān)蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示，H2O2可損傷神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白表達，加入神經(jīng)復(fù)元方的血清可以有效修復(fù)這種損傷，若加入K252a阻斷了BDNF/TrKB信號傳導(dǎo)通路則抑制了藥物的修復(fù)作用。

圖3 Western blot檢測的各組神經(jīng)元相關(guān)蛋白灰度分析

圖4 各組SYNA、GAP-43、SYNI蛋白表達水平

討 論

PSD是發(fā)生在卒中后的一系列郁證的表現(xiàn)，屬本虛標(biāo)實之證，病位多責(zé)之于腦，發(fā)病多涉及心、肝、脾、腎等諸臟，與風(fēng)、痰、瘀、虛有關(guān)，治療當(dāng)滋心補腎，同時疏肝利氣、化痰祛瘀、健脾養(yǎng)心。近年來，多項研究證實中醫(yī)藥治療PSD臨床療效較好[7]，可以增加PSD大鼠5-HT的含量[8]。神經(jīng)復(fù)元方源于名老中醫(yī)李如奎教授的臨床驗方，在臨床應(yīng)用治療中風(fēng)后遺癥及卒中后抑郁長達15年之久，可以有效改善PSD患者神經(jīng)功能缺損及抑郁狀態(tài)。

文獻研究證實，BDNF與其特異性受體TrkB結(jié)合形成BDNF-TrkB 信號通路，在神經(jīng)活動的刺激下參與神經(jīng)元細胞的存活和生長發(fā)育，調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性[9]。TrkB酪氨酸磷酸化是整個信號傳遞系統(tǒng)的啟動程序。其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮，是在BDNF與TrkB 結(jié)合后，主要經(jīng)由癌基因Ras編碼的Ras蛋白通路實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，使神經(jīng)元免受谷氨酸的毒性作用，同時能激活MAPK及PI3K信號通路。MAPK通路激活可促進神經(jīng)生存，增加突觸可塑性和神經(jīng)再生，而PI3K通路不僅可以發(fā)揮促存活效應(yīng)，還能對幼稚神經(jīng)元的建立及神經(jīng)元的遷徙起重要作用。多項研究發(fā)現(xiàn)其與PSD相關(guān)，Luo L等[10]的研究發(fā)現(xiàn)慢性抗抑郁藥物對缺乏TrkB受體的PSD模型大鼠無明顯療效。同時Lawlor-Savage L等[11]的研究亦發(fā)現(xiàn)在PSD模型大鼠中過表達TrkB受體，能夠起到類似抗抑郁的作用。Su Q等[12]研究發(fā)現(xiàn)在PSD模型大鼠海馬區(qū)域直接注入BDNF可以起到抗抑郁作用，并對海馬區(qū)神經(jīng)元的增殖和分化具有促進作用。在2018歐洲精神神經(jīng)藥理學(xué)會(ECNP)年會上，著名神經(jīng)生物學(xué)專家Eero Castren博士報道，BNDF-TrkB信號通路，在神經(jīng)活動的刺激下與神經(jīng)突觸晚期長時程增強相互影響，從而在調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活及神經(jīng)突觸可塑性上發(fā)揮著重要作用。

因此，我們推測神經(jīng)復(fù)元方是通過介導(dǎo)BDNF-TrkB信號通路發(fā)揮抗抑郁治療作用，該信號通路是海馬神經(jīng)重塑性的關(guān)鍵“傳動者”。本實驗采用原代大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型，引入BDNF/TrkB通路抑制劑(K252a)，對照研究了神經(jīng)復(fù)元方治療PSD的部分分子機制。通過定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，H2O2組神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白SYNA、SYNI的基因表達相比正常對照組明顯下降，經(jīng)含有神經(jīng)復(fù)元方的血清干預(yù)后，含藥血清+ H2O2培養(yǎng)組的SYNA、SYNI的基因表達水平得到提升，基本與正常對照組相當(dāng)，而加入BDNF-TrkB信號通路阻斷劑K252a和含藥血清的組，神經(jīng)元突觸蛋白SYNA、SYN I的表達水平并無明顯提升。通過蛋白質(zhì)印跡法定量檢測BDNF/TrkB信號通路突觸可塑性相關(guān)蛋白SYNA、SYNI和突觸生長相關(guān)蛋白GAP-43的表達水平，結(jié)果基本與定量RT-PCR的一致，含藥血清+ H2O2培養(yǎng)組SYNA、SYNI的蛋白表達水平顯著高于H2O2培養(yǎng)組，基本上恢復(fù)到正常對照組水平。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)含藥血清+ H2O2培養(yǎng)組相比H2O2培養(yǎng)組神經(jīng)元突觸密度增大，突觸后致密物厚度增厚。

綜合以上情況，我們認(rèn)為神經(jīng)復(fù)元方能夠修復(fù)海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型的突觸可塑性，其作用發(fā)揮與BDNF/TrKB信號通路密切相關(guān)，可能是通過介導(dǎo)該信號通路調(diào)節(jié)突觸蛋白基因，促進海馬SYNI和SYNA的表達，從而達到修復(fù)神經(jīng)功能的作用，但其作用機制有待進一步深入研究。