王 歡

(廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系，廣東 廣州 510405)

研究表明，血清膽固醇的升高與冠心病風險增加有關(guān)，每高于正常膽固醇水平1 mmol，冠心病的風險增加35%[1]，冠狀動脈死亡風險增加45%；血清膽固醇降低1%[2-3]，冠心病風險將降低2%～3%[4]。含有益生菌的乳制品可降低血清膽固醇水平，但其機制尚不明晰[5]。一些乳酸桿菌可降低總膽固醇、膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇[6-7]。

嗜酸乳桿菌菌株可分泌膽鹽(膽堿甘氨酸水解酶，酶代碼EC3.5.1.24)，催化甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合膽鹽水解為氨基酸殘基和游離膽鹽[8]，游離膽鹽的可溶性低于結(jié)合膽鹽，導(dǎo)致腸腔吸收率降低。膽汁酸的解聚可通過增加新的膽汁酸來降低血清膽甾醇—萜醇的水平[9]，這些新的膽汁酸取代了腸肝循環(huán)的膽汁酸。嗜酸乳桿菌在生長過程中可將培養(yǎng)基中的一些膽固醇合并到細胞膜中，被合并的膽固醇從腸道進入到血液中的可能性較小[10]，說明嗜酸乳桿菌細胞中的膽固醇可以改變機體的細胞膜或細胞壁。研究[11-12]顯示，只有一部分革蘭氏陽性細胞在有膽固醇染色的情況下生長，而所有未經(jīng)膽固醇染色的革蘭氏陽性細胞都實現(xiàn)了生長。體外試驗[13-14]表明，能吸收膽固醇的乳酸桿菌菌株在體內(nèi)也能降低膽固醇。膽固醇同化與膽汁鹽的存在有關(guān)，并且隨著膽汁鹽濃度的增加，從培養(yǎng)基中去除的膽固醇水平增加。然而，嗜酸乳桿菌的耐膽汁菌株沒有表現(xiàn)出良好的吸收膽固醇的能力；具有最小膽汁耐受性的菌株實際上吸收了更多的膽固醇。非發(fā)酵冷藏期間，嗜酸乳桿菌菌株的膽固醇攝取與細菌的生長和生存能力有關(guān)，且其膽固醇同化能力依賴于生長[15-17]。

試驗擬對11株乳酸桿菌的抗菌特性(耐酸性和膽汁耐受性)進行研究，并分析其去除膽固醇的能力，以期對膽固醇去除的可能機制有所裨益，為開發(fā)能在體內(nèi)降低血清膽固醇的膳食添加劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)：生物實驗室；

干酪乳桿菌CSCC 2607(LactobacilluscaseiCSCC 2607)：澳大利亞Highett公司；

干酪乳桿菌ASCC 1520(L.caseiASCC 1520)、干酪乳桿菌ASCC 1521(L.caseiASCC 1521)、干酪乳桿菌ASCC 279(L.caseiASCC 279)、干酪乳桿菌ASCC 290(L.caseiASCC 290)、干酪乳桿菌ASCC 292(L.caseiASCC 292)和干酪乳桿菌ATCC 15820(L.caseiATCC 15820)：生物實驗室發(fā)酵劑培養(yǎng)中心；

蛋白胨水稀釋劑：上海江萊生物科技有限公司；

氫氧化鉀、無水乙醇、鄰苯二甲醛：分析純，南京安倫化工科技有限公司；

厭氧罐：TU-190Z型，美國Sparks公司；

氣體生成試劑盒：英國West Heidelberg公司；

分光光度計：GN-12A型，上海谷寧儀器有限公司；

離心機：L-8900型，日立高新科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將培養(yǎng)物儲存于-80 ℃， 40%的甘油中。使用1%的接種物在無菌的De-Man、Rogosa、Sharpe(MRS)肉湯中培養(yǎng)3次，并于37 ℃下培養(yǎng)20 h。

1.2.2 耐酸性 11株嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌在試驗前至少進行3次傳代，最后一次傳代后離心，按10%接種到含0.30%牛肝糖的MRS肉湯中，用鹽酸將pH調(diào)至2.0，37 ℃下培養(yǎng)，并使用平板計數(shù)法[18]進行生長監(jiān)測。連續(xù)稀釋前，對含有益生菌培養(yǎng)物的發(fā)酵液進行5 s的超聲波處理以破壞乳酸桿菌叢，連續(xù)稀釋的空白組單獨旋渦處理30 s。每隔30 min取1 mL樣品，持續(xù)2 h，用蛋白胨水稀釋劑連續(xù)稀釋10倍。將樣品電鍍到MRS瓊脂上，37 ℃，厭氧罐和氣體生成試劑盒中培養(yǎng)24 h，通過最終平板計數(shù)與初始平板計數(shù)確定耐酸性，所有試驗重復(fù)兩次。

1.2.3 膽汁耐受性 每種菌株接種含有質(zhì)量分數(shù)0.30%的牛肝膽、膽酸或?；悄懰岬腗RS肉湯，并于37 ℃下培養(yǎng)，對照組為不含膽鹽的MRS肉湯。使用分光光度計于620 nm處測定培養(yǎng)7～8 h的吸光度。每個菌株的膽汁耐受性基于吸光度值增加0.3個單位所需時間。測定所有發(fā)酵液的初始pH值，并在吸光度增加0.3個單位后再次測量。所有試驗重復(fù)兩次。

1.2.4 膽固醇去除 新制備的MRS肉湯添加0.30%的牛肝糖作為膽汁鹽。將水溶性膽固醇(聚氧乙烷基膽固醇酯癸酸酯)過濾滅菌，以70～100 μg/mL的最終濃度添加到肉湯中，按1%接種每種菌株，并于37 ℃下厭氧培養(yǎng)20 h，離心細胞。向1 mL等分試樣中加入1 mL 33%的氫氧化鉀和2 mL無水乙醇，旋轉(zhuǎn)1 min，37 ℃下加熱15 min。冷卻后，加入2 mL脫分水和3 mL己烷，將1 mL己烷層轉(zhuǎn)移到玻璃管中，氮氣環(huán)境下蒸發(fā)，殘渣立即溶解于2 mL鄰苯二甲醛試劑中，混合均勻后，添加0.5 mL濃硫酸，并將混合物旋轉(zhuǎn)1 min。10 min后測定550 nm處吸光度。所有試驗重復(fù)兩次。

1.2.5 死細胞和靜息細胞清除膽固醇能力 將新制備的含0.30%牛膽汁的MRS肉湯接種到每一株乳酸桿菌中，并于37 ℃下培養(yǎng)20 h，4 ℃下離心10 min，培育期后收獲細胞。用無菌蒸餾水洗滌細胞兩次。將細胞顆粒懸浮于10 mL無菌蒸餾水中，121 ℃下蒸壓15 min制備熱滅細胞[19]。將熱滅細胞懸浮于含0.30%的牛膽汁和水溶性膽固醇的MRS肉湯中。將細胞顆粒懸浮于10 mL無菌0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，含有水溶性膽固醇)中制備靜息細胞。所有菌株于37 ℃下培養(yǎng)20 h，并測定肉湯中的膽固醇含量，所有試驗重復(fù)兩次。生長、靜息和熱滅細胞的膽固醇同化以干重的形式表達，并按式(1)進行計算[20-21]。

S=(C1-C2)/(W2-W1)，

(1)

式中：

S——膽固醇同化量；

C1、C2——發(fā)酵液中0，20 h時的膽固醇含量，g；

W1、W2——個體培養(yǎng)物在0，20 h時的干重，g。

1.2.6 統(tǒng)計分析 使用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析顯著性。使用Tukey檢驗對平均值進行多次比較，結(jié)果以(平均值±標準誤差)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐酸性

由表1可知，所有菌株對pH 2.0的耐受時間均為2 h。嗜酸乳桿菌ATCC 4962、干酪乳桿菌ASCC 290和干酪乳桿菌ASCC 292為最耐酸的菌株，在pH 2.0下培養(yǎng)2 h后，其耐酸性超過107CFU/mL；而干酪乳桿菌ASCC 1520、干酪乳桿菌ASCC 1521、干酪乳桿菌ASCC 279、干酪乳桿菌ATCC 15820和干酪乳桿菌CSC 2607是酸敏感的菌株，培養(yǎng)2 h后，其總耐酸性為104CFU/mL。嗜酸乳桿菌的菌落形成單位在培養(yǎng)的第1 h減少了2.41～2.79個對數(shù)值，而干酪乳桿菌減少了1.58～2.26個對數(shù)值。嗜酸乳桿菌菌株在整個培養(yǎng)期間表現(xiàn)出更大的耐酸性，活菌數(shù)減少了2.66～4.38個對數(shù)值，而干酪乳桿菌的減少了3.16～6.20個對數(shù)值。干酪乳桿菌CSCC 2607是最不耐酸性的菌株，培養(yǎng)期間，活菌數(shù)減少了6.31個對數(shù)值，其中培養(yǎng)的第2 h減少了4.20個對數(shù)值。

2.2 膽汁耐受性

由表2可知，培養(yǎng)基pH值下降最大幅度出現(xiàn)在干酪乳桿菌ASCC 290和CSCC 2607，添加了膽酸的培養(yǎng)基的初始pH值最低，但添加了牛膽汁的培養(yǎng)基的平均還原率最高，而最低的pH值來自于添加了牛磺膽酸的培養(yǎng)基(0.11)。說明不同膽汁來源培養(yǎng)基的初始酸堿度對培養(yǎng)物的后續(xù)生長和膽汁耐受性以及膽汁鹽的酸堿抑制作用影響較小。多數(shù)嗜酸乳桿菌菌株在無膽汁的MRS肉湯中的生長均優(yōu)于干酪乳菌株。嗜酸乳桿菌ATCC 4356在膽汁鹽(牛膽汁和膽酸)和不含膽汁的情況下表現(xiàn)出相似的生長特性，而在含牛膽汁的MRS肉湯中，干酪乳桿菌ASCC 290的生長受到抑制(相較于對照組)。所有菌株在含有膽酸的MRS肉湯中生長速度更快；在含?；悄懰岬腗RS肉湯中生長速度較慢。在膽酸存在下，干酪乳桿菌ASCC 1520、干酪乳桿菌ASCC 1521、干酪乳桿菌ASCC 290、干酪乳桿菌ATCC 15820和嗜酸乳桿菌ATCC 4357對膽汁的耐受性最強，而嗜酸乳桿菌ATCC 4356和干酪乳桿菌CSC 2607的耐受性最低，大多數(shù)干酪乳桿菌菌株對膽酸的耐受性均優(yōu)于嗜酸乳桿菌。?；悄懰岽嬖谙赂衫胰闂U菌的緩慢生長可能受其在MRS中緩慢生長的影響，而不是受結(jié)合膽汁的抑制作用[24]。嗜酸乳桿菌ATCC 33200、嗜酸乳桿菌ATCC 4357、嗜酸乳桿菌ATCC 4962和干酪乳桿菌ASCC 1521對?；悄懰岬哪褪苄宰顝?，干酪乳桿菌ASCC 279的耐受性最低(P<0.05)。干酪乳桿菌ASCC 1520、干酪乳桿菌ASCC 292、干酪乳桿菌ATCC 15820和嗜酸乳桿菌ATCC 33200的耐受性要優(yōu)于干酪乳桿菌ASCC 1521、干酪乳桿菌ASCC 279和干酪乳桿菌ASCC 290。

表1 嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌對活菌數(shù)的影響Table 1 Viability of Lactobacillus acidophilus and L. casei (pH 2.0) lg CFU/mL

表2 嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌的膽汁耐受性?Table 2 Bile Tolerance of Lactobacillus acidophilus and L. casei in media min

?T表示每種介質(zhì)在620 nm處增加0.3個吸光度單位所需的時間；T1、T2分別表示初始時間及吸光度增加0.3單位的時間。

2.3 乳酸桿菌對膽固醇的同化作用

由表3可知，不同菌株的膽固醇去除能力不同(P<0.05)，為3.76～34.69 μg/mL。與對照組相比，干酪乳桿菌在膽酸存在下吸收了更多的膽固醇。在膽酸存在下，干酪乳桿菌的總膽固醇去除能力高于嗜酸乳桿菌的，干酪乳桿菌ASCC 1520、干酪乳桿菌ASCC 1521、干酪乳桿菌ASCC 292、干酪乳桿菌ATCC 15820和嗜酸乳桿菌ATCC 4962吸收了25 μg/mL以上的膽固醇，并優(yōu)于嗜酸乳桿菌ATCC 4356、嗜酸乳桿菌ATCC 4357和干酪乳桿菌CSC 2607吸收的膽固醇(≤15 μg/mL)。在?；悄懰岽嬖谙?，多數(shù)乳酸桿菌菌株的膽固醇含量較低(相較于對照組)，嗜酸乳桿菌L.acidophilusATCC 33200和干酪乳桿菌L.caseiASCC 1521的膽固醇去除能力最大(>20 μg/mL)，但低于其膽汁鹽。嗜酸乳桿菌的膽固醇去除能力明顯高于干酪乳桿菌的。在牛膽汁存在下，膽固醇去除能力為12.03～32.25 μg/mL。除嗜酸乳桿菌ATCC 4357、干酪乳桿菌ASCC 279和干酪乳桿菌ASCC 290菌外，大多數(shù)菌株的膽固醇去除能力高于對照組，而不同處理生物量水平可能對膽固醇濃度有影響[15]。因此，后續(xù)進一步研究膽固醇同化模式及生長、熱滅和休眠細胞去除膽固醇的能力。

由圖1、2可知，除嗜酸乳桿菌ATCC 4962、酪蛋白1520和酪蛋白1521外，大多數(shù)菌株在膽固醇存在的情況下表現(xiàn)出較高的生長速度，而在無膽固醇的情況下表現(xiàn)出較緩慢的生長速度。在不含膽固醇的情況下，大多數(shù)菌株在培養(yǎng)第9～15 h內(nèi)生長較快，隨后生長較慢直到培養(yǎng)結(jié)束；在膽固醇存在的情況下，大多數(shù)菌株在培養(yǎng)第12～18 h內(nèi)生長緩慢，隨后迅速生長。不同菌株的膽固醇同化模式不同，其去除膽固醇的能力與生長相關(guān)。

表3 不同膽汁中乳酸桿菌的膽固醇去除能力Table 3 Cholesterol assimilation level of Lactobacillus in different biles μg/mL

圖1 嗜酸乳桿菌在含/不含膽固醇的培養(yǎng)基中的生長概況Figure 1 Growth and cholesterol assimilation patterns of Lactobacillus acidophilus in media with and without cholesterol

圖2 干酪乳桿菌在含/不含膽固醇的培養(yǎng)基中的生長概況Figure 2 Growths and cholesterol assimilation pattems of Lactobacillus casei in media with and without cholesterol

2.4 生長、熱滅和休眠細胞的膽固醇去除能力

由圖3可知，熱滅細胞和靜息細胞的膽固醇去除能力較小，為0.79～3.82 mg/g，而生長細胞的為4.53～16.03 mg/g。大多數(shù)菌株在細胞懸浮于磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中時，其膽固醇去除能力高于熱滅細胞的，且在細胞熱滅時，干酪乳桿菌ASCC 1520的膽固醇去除能力高于靜息細胞。這是由于干酪乳桿菌ASCC 292、干酪乳桿菌 ATCC 15820和干酪乳桿菌 ASCC 1520在生長過程中吸收了更多的膽固醇，但在休息或熱滅時不吸收。嗜酸乳桿菌ATCC 4357和干酪乳桿菌ASCC 1521在生長過程中吸收的膽固醇較少，但在細胞靜息和熱滅時表現(xiàn)出相對較高的膽固醇去除能力；而干酪乳桿菌ASCC 279和干酪乳桿菌ASCC 290在生長過程中吸收了最低水平的膽固醇。

圖3 生長、休眠和熱滅細胞的膽固醇去除能力Figure 3 Cholesterol removal by growing, resting,and heat-killed cells

3 結(jié)論

對11株乳酸桿菌的膽汁耐受性、耐酸性和降膽固醇能力進行了研究。結(jié)果表明，所有乳酸桿菌菌株在不同的酸性條件和膽汁濃度下均能存活；所有乳酸桿菌菌株均能在12.03～32.25 μg/mL的水平同化膽固醇，且其去除能力與培養(yǎng)物的生長有關(guān)；熱滅和休眠細胞清除膽固醇的能力為0.79～3.82 mg/g，生長細胞的為4.53～16.03 mg/g。綜上，干酪乳桿菌ASCC 292和嗜酸乳桿菌ATCC 4962菌株表現(xiàn)出良好的耐酸性和耐膽汁性，且其膽固醇去除能力最強。研究進一步說明了乳酸桿菌菌株可通過多種機制去除膽固醇，可作為降低血清膽固醇的膳食添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)。后續(xù)將繼續(xù)探究乳酸桿菌去除膽固醇的具體作用機理。