劉宇涵，于佳楠，馬金鳳，何 玲，陶 碩，范文博，丁玉萍，2

（1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154002；2.中-烏農(nóng)林技術開發(fā)與應用國際合作聯(lián)合實驗室，黑龍江佳木斯 154007）

發(fā)酵香腸最早出現(xiàn)在地中海地區(qū)，隨著經(jīng)濟、技術和工業(yè)的進步，人們生活水平的提高和健康意識的提高，發(fā)酵香腸產(chǎn)品的開發(fā)和發(fā)展備受關注[1]。最初的自然發(fā)酵，是富集在環(huán)境中的天然微生物，產(chǎn)品品質很難保證[2-3]。如今，多采用現(xiàn)代生物技術和控制發(fā)酵條件，人工添加發(fā)酵劑與自然發(fā)酵相比，現(xiàn)代發(fā)酵香腸在營養(yǎng)、風味、穩(wěn)定性等方面都得到了提高。傳統(tǒng)香腸通常添加亞硝酸鹽，亞硝酸鹽除了可作為肉的保護劑、改善肉的顏色以外，還能改善肉類風味，對肉毒桿菌也有特殊的抑制作用，起到防腐劑的效果，是國家列入允許使用的食品添加劑之一[4-8]。但已有研究表明，亞硝酸鹽與肉制品中的胺在一定條件下會生成亞硝胺，有潛在的致癌作用，影響人體健康，所以國家對亞硝酸鹽的使用量有嚴格規(guī)定，亞硝酸鹽殘留問題一直被世界衛(wèi)生組織所關注[9-12]。

近年來，市場上食用菌生產(chǎn)量高、品種多樣、價格便宜、口感獨特，如杏鮑菇具有愉悅的杏仁香味和鮑魚口感，質地脆嫩、肉質肥厚、口感鮮嫩、味道清香[13-14]。香腸中加入食用菌，不僅口感可以得到改善，而且對人體健康有益?，F(xiàn)代研究表明，食用菌中所含的多糖、維P、氨基酸和麥角固醇等營養(yǎng)物質，能增強機體的抗病能力，提高機體抑制腫瘤的能力，具有鎮(zhèn)靜血壓、降低膽固醇、預防動脈硬化等功能[15-22]。目前，可查到的相關文獻，多數(shù)為益生菌降低亞硝酸鹽的研究。例如，Li Pei Jun等人[23]向生肉糜中加入木糖葡萄球菌和戊糖片球菌，發(fā)現(xiàn)它們有將高鐵肌紅蛋白轉換為亞硝基肌紅蛋白的能力，從而可以減少亞硝酸鹽的含量。崔玨等人[24]從酸菜中篩選降解亞硝酸鹽能力強且適用于肉制品發(fā)酵的乳酸菌-鼠李糖乳桿菌，以篩選的菌株為發(fā)酵劑制作單菌株發(fā)酵香腸，通過檢測證明，鼠李糖乳桿菌能有效降低發(fā)酵香腸中的NaNO2含量。在香腸中添加食用菌的研究也有報導，段善海等人[25]研究在香腸中添加一定量的雞腿菇，可使香腸具有獨特的風味和良好的營養(yǎng)保健作用。探究食用菌對益生菌降解亞硝酸鹽的影響尚未見報導。研究是在混合益生菌發(fā)酵香腸中添加食用菌，以益生菌對亞硝酸鹽的降解率為評價指標，利用單因素試驗和正交試驗方法，探究平菇、杏鮑菇、金針菇、香菇4種食用菌單一添加或混合添加對香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽的影響，旨在為添加食用菌的益生菌發(fā)酵香腸的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

金針菇、平菇、杏鮑菇、香菇、食鹽、黃豆、奶粉，購自佳木斯超市；食品級亞硝酸鹽，購自食品添加劑商店。

1.1.2 菌種

益生菌菌種（嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌），佳木斯大學發(fā)酵工程實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

模擬培養(yǎng)基（1 kg）：奶粉20 g，蔗糖30 g，亞硝酸鹽150 mg，食鹽15 g，折光度5%豆?jié){定量至1 kg，于115℃下滅菌15 min。

活化培養(yǎng)基（1 L）：奶粉20 g，蔗糖30 g，用折光度5%豆?jié){定容至1 L，于121℃下滅菌15 min。

1.1.4 化學試劑

鹽酸納乙二胺（分析純），天津市北方天醫(yī)化學試劑廠提供；亞鐵氰化鉀（分析純），哈爾濱市新達化工廠提供；硼砂（分析純），天津市瑞金特化學品有限公司提供；亞硝酸鹽（分析純），北京奧博星生物技術有限責任公司提供；對氨基苯磺酸（分析純），哈爾濱化工化學試劑廠提供；乙酸鋅（分析純），天津市凱通化學試劑有限公司提供；冰乙酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；鹽酸（分析純），新海乳溶廠提供。

1.2 試驗儀器

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產(chǎn)品；UV754型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；JYD-D02V/D57型組織破碎機，長沙湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品；SpectrumLab22PC型超聲波清洗器，上海棱光技術有限公司產(chǎn)品；HH-Z2型恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；PHS-2C型數(shù)顯酸度計，杭州雷磁分析儀器廠；標準型凈化工作臺，上海躍進醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；AB104-S型電子天平，METTLER TOLEDO Made in Switzerland產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 混合益生菌菌種的活化

將保存的益生菌菌種按1∶1∶1∶1比例接入活化培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，取出備用。

1.3.2 食用菌處理

食用菌清洗后，用組織破碎機破碎，按比例添加至模擬培養(yǎng)基中。

1.3.3 接種

按6%的接種量接入活化后的混合益生菌菌種。

1.3.4 發(fā)酵

將接種后的模擬培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出，測定亞硝酸鹽含量，計算降解率。

1.3.5 亞硝酸鹽殘留量測定

參照GB 5009.33—2016中分光光度法測定樣品中亞硝酸鹽含量。

亞硝酸鹽標準曲線見圖1。

圖1 亞硝酸鹽標準曲線

1.3.6 亞硝酸鹽含量的降解率

式中：P——亞硝酸鹽的降解率，%；

X1——試樣中亞硝酸鈉的含量，mg/kg；

100.93 ——加入150 mg/kg食品級亞硝酸鹽的模擬培養(yǎng)基未發(fā)酵前測得亞硝酸鹽的含量，mg/kg。

1.3.7 單因素試驗設計

對平菇、杏鮑菇、香菇、金針菇4種食用菌的添加量進行單因素試驗，4種食用菌添加量的梯度設置均為0，20，40，60，80 g/kg。按6%的接種量接入活化后混合益生菌菌種，于37℃下培養(yǎng)24 h，取出測亞硝酸鹽含量及pH值。各組做3個重復，結果取平均值。

1.3.8 正交試驗設計

為了探究4種食用菌同時添加對降低亞硝酸鹽的影響，以平菇、杏鮑菇、香菇、金針菇為考查因素，利用四因素三水平L9（34）正交試驗表進行試驗。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計/g·kg-1

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 平菇對降低亞硝酸鹽的影響平菇單因素試驗結果見圖2。

圖2 平菇單因素試驗結果

由圖2可知，添加平菇的亞硝酸鹽降解率均比未添加平菇的高。用量從2 g/kg至80 g/kg亞硝酸鹽降解率呈正態(tài)分布。未添加平菇的亞硝酸鹽降解率為83.27%；用量為60 g/kg降解率最高為96.36%，比未添加平菇降解率高6.94%，同時平菇用量為60 g/kg時，pH值為3.26是5組中最低的，添加平菇組的pH值均比未添加平菇組的低。

2.1.2 杏鮑菇對降低亞硝酸鹽的影響

杏鮑菇單因素試驗結果見圖3。

由圖3可知，添加杏鮑菇的亞硝酸鹽降解率均比未添加杏鮑菇的高。用量從20 g/kg至80 g/kg壓硝酸鹽降解率呈正態(tài)分布，最高值比最低值高3.47%，差異不顯著；未添加杏鮑菇的亞硝酸鹽降解率為83.27%；用量為40 g/kg降解率最高為93.88%，比未添加杏鮑菇降解率高10.61%。亞硝酸鹽降解率最高組pH值最低，之后隨著杏鮑菇量的增加，pH值有所升高。

圖3 杏鮑菇單因素試驗結果

2.1.3 香菇對降低亞硝酸鹽的影響

香菇單因素試驗結果見圖4。

圖4 香菇單因素試驗結果

由圖4可知，香菇用量從20 g/kg至80 g/kg亞硝酸鹽降解率呈正態(tài)分布，均比未添加香菇的高；未添加香菇的亞硝酸鹽降解率為83.27%；香菇用量40 g/kg時降解率最高為93.72%，比未添加香菇降解率高10.45%。同時添加香菇的pH值均比未添加香菇的低，用量為40 g/kg組，pH值最低3.17。

2.1.4 金針菇對降低亞硝酸鹽的影響

金針菇單因素試驗結果見圖5。

圖5 金針菇單因素試驗結果

由圖5可知，添加金針菇組亞硝酸鹽降解率均高于未添加金針菇組。用量從20 g/kg至80 g/kg亞硝酸鹽降解率呈正態(tài)分布；未添加金針菇的亞硝酸鹽降解率為83.27%；用量為60 g/kg降解率最高為95.69%，比未添加金針菇降解率高12.42%。同時金針菇用量為60 g/kg時，pH值為3.15是5組中最低的，添加金針菇的pH值均比未添加金針菇的低。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗結果與分析

按6%的接種量接入活化后的混合益生菌菌種，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，取出測亞硝酸鹽，計算降解率。

正交試驗結果與數(shù)據(jù)分析見表2。

表2 正交試驗結果與數(shù)據(jù)分析

由表 2 可知，RC＞RB＞RA＞RD，4 種食用菌對香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽的影響均具有促進作用，影響從大到小依次為金針菇＞杏鮑菇＞平菇＞香菇。A因素列：K2＞K1＞K3，B 因素列：K3＞K2＞K1，C 因素列：K2＞K3＞K1，D 因素列：K2＞K3＞K1。由此可以得出正交試驗優(yōu)化的組合為A2B3C2D2，即平菇20 g/kg，杏鮑菇30 g/kg，金針菇用量20 g/kg，香菇用量20 g/kg。最好組為2號組合A1B2C2D2（Z1）和4號組合A2B1C2D3（Z2），降解率相同，均為98.12%。

2.2.2 對比驗證試驗

對正交試驗得出較好的3個組合，即Y（A2B3C2D2），Z1（A1B2C2D2），Z2（A2B1C2D3），做對比驗證試驗，計算降解率。

混合食用菌對香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽影響見圖5。

圖5 混合食用菌對香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽影響

由圖5可知，比較3組的降解率最高組Z1為98.36%；其次為Y組為98.04%，比Z1組低0.32%；最低的是Z2組為97.87%，比最高組低0.49%。因此，正交試驗優(yōu)化的最佳組合為Z1組，即4種食用菌的用量分別為平菇10 g/kg，杏鮑菇20 g/kg，金針菇20 g/kg，香菇20 g/kg。

3 結論

通過單因素試驗得出，4種食用菌單獨添加時各用量為平菇60 g/kg，杏鮑菇40 g/kg，香菇40 g/kg，金針菇60 g/kg，此時食用菌對香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽影響最好，降解率高。單因素試驗結果表明，添加食用菌組亞硝酸鹽降解率均比未添加食用菌組高；添加食用菌組的pH值均比未添加食用菌組低。降解率最高組，pH值最低，說明添加食用菌能促進香腸發(fā)酵益生菌的代謝，產(chǎn)酸量多，并促進亞硝酸鹽的分解，提高降解率。

利用正交試驗對4種食用菌進行組合試驗得出，4種食用菌組合用量分別為平菇10 g/kg，杏鮑菇20 g/kg，金針菇20 g/kg，香菇20 g/kg時，香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽的效果最好，降解率為98.36%。通過比較單因素試驗和正交試驗結果，添加總量相近時，4種食用菌混合添加比單獨添加一種食用菌促進益生菌降低亞硝酸鹽降解效果好。使用的混合益生菌是由嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌所組成，均屬于乳酸菌，而乳酸菌本身合成核酸和氨基酸的能力較弱，生長和代謝需要特殊營養(yǎng)物質。