楊艷，歐陽(yáng)偉煒，蘇勝發(fā)，馬筑，李青松，耿一超，盧冰

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 腫瘤科，貴州省腫瘤醫(yī)院 腫瘤科，貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 腫瘤學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織中最主要的細(xì)胞，可分泌多種生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化。成纖維細(xì)胞是心臟組織的主要組成成分，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)出生后1 d時(shí)大鼠心臟成纖維細(xì)胞約占30%，出生后15 d時(shí)則約占64%[1]。成纖維細(xì)胞主要是通過(guò)合成及分泌膠原蛋白、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，提供給心臟一個(gè)完整的網(wǎng)狀支撐系統(tǒng)，在維持心臟結(jié)構(gòu)、功能、生物化學(xué)和電機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[1-3]。心臟成纖維細(xì)胞已用于心肌梗死后心臟纖維化、缺血缺氧再灌注、血管重構(gòu)等體外研究模型，是目前研究心血管疾病的方法之一[4-6]。鼠心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法主要包括酶消化法及組織塊貼壁法。酶消化法主要包括胰蛋白酶消化、蛋白酶消化過(guò)夜再用Ⅱ型膠原蛋白酶消化以及蛋白酶混合Ⅰ型膠原酶聯(lián)合消化，分別用胰酶、Ⅱ型膠原酶依次消化分離心肌組織，再通過(guò)兩次差速貼壁分離法等。在實(shí)驗(yàn)中所采用酶種類、濃度、順序、消化時(shí)間及次數(shù)，是否水浴過(guò)夜、差速貼壁的次數(shù)、消化程度等均有所不同，本實(shí)驗(yàn)采用兩種酶混合短時(shí)間多次消化的方法進(jìn)行消化分離心臟成纖維細(xì)胞，通過(guò)觀察培養(yǎng)的乳鼠心臟成纖維細(xì)胞、探討其在胸部放射治療中導(dǎo)致心臟放射性損傷的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 出生24 h SPF級(jí)SD大鼠乳鼠30只，雌雄不限，體質(zhì)量(6±0.5)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2主要儀器和試劑 超凈工作臺(tái)，4～20 ℃冰箱，5% 37 ℃的CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，細(xì)胞離心機(jī)，細(xì)胞爬片。DMEM高糖培養(yǎng)基(gibco公司，美國(guó))、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(gibco公司，美國(guó))，0.2%膠原酶Ⅱ(Sigma 公司，美國(guó))、兔抗Vimentin單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋有限公司)。

1.2 方法

1.2.1取材 將SD乳鼠置于75%酒精缸中浸泡10 s，劍突向上剖開(kāi)胸腔、暴露心臟，用無(wú)菌眼科剪剪取心尖置離心管的PBS液中冰凍，將取好的心臟組織轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)房的超凈工作臺(tái)中，用預(yù)冷的PBS漂洗3～5次后放入已滅菌的青霉素小瓶中，充分剪碎心臟成糜肉狀，再次漂洗3～5次，將糜肉狀的心臟組織平均分裝至5～6支15 mL離心管中。

1.2.2酶消化分離培養(yǎng) 將消化酶與剪碎的心臟組織體積按1 ∶3的比例加入15 mL離心管中，加入0.25%胰蛋白酶及0.2% Ⅱ型膠原酶以1 ∶1混合，吹打30～60 s封口后轉(zhuǎn)移于37 ℃恒溫水浴鍋中充分震蕩搖晃8～10 min，用無(wú)菌吸管吸取上清后用100目的篩網(wǎng)過(guò)濾；將收集的上清液放入15 mL離心管，并加入同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。將15 mL離心管中未消化的組織再次加入消化酶并吹打30～60 s后再次轉(zhuǎn)移至于37 ℃恒溫水浴鍋中充分震蕩搖晃8～10 min后吸取上清，同法消化3～5次至組織消失，僅剩下白色透明的膠原纖維組織。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 將分次收集的細(xì)胞懸液以1 000 r/min，5 min離心2次，棄掉上清液，加入10%胎牛血清高糖DMEM 5 mL重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后接種到25 mL培養(yǎng)瓶中。移到5% 37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90～120 min，差速貼壁后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)心肌細(xì)胞，補(bǔ)充10%胎牛血清高糖DMEM于培養(yǎng)瓶中，再置于5% 37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換1次培養(yǎng)液。當(dāng)心臟成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底體積達(dá) 80%～90%時(shí)，用2.5 g/L 胰蛋白酶1 mL消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.2.4心臟成纖維細(xì)胞鑒定 (1)形態(tài)學(xué)觀察，將培養(yǎng)的原代心臟成纖維細(xì)胞在0、24、48及72 h時(shí)間點(diǎn)用100倍數(shù)倒置相差顯微鏡觀察原代成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。(2)Vimentin免疫組化染色鑒定，選2～4代的心臟成纖維細(xì)胞，按5X104接種于置有細(xì)胞爬片的12孔板中，于5% 37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。用多聚甲醛固定40 min，H2O2室溫孵育30 min，Tritonx-100通透30 min，BSA室溫封閉。加入200 μL不同濃度的Vimentin抗體，置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，加入100 μL二抗，室溫孵育30 min。DAB閉光染色，蘇木素復(fù)染。將細(xì)胞爬片通過(guò)不同濃度梯度的酒精脫水。用二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。染色完成后立即進(jìn)行倒置顯微鏡觀察細(xì)胞染色。

2 結(jié)果

2.1 心臟成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性

培養(yǎng)90～120 min時(shí)可見(jiàn)較多貼壁的成纖維細(xì)胞，在倒置顯微鏡下呈球形亮點(diǎn)或已貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞(圖1A)；24 h后細(xì)胞逐漸由圓形伸展為三角形、扁平形、長(zhǎng)梭形及不規(guī)則多邊形，且貼壁細(xì)胞數(shù)量增多(圖1B)；培養(yǎng)2 d后可見(jiàn)成纖維細(xì)胞數(shù)量較前增多，形態(tài)多樣且輪廓清晰，部分有多個(gè)偽足突起，細(xì)胞核邊界清楚，核仁明顯，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，生長(zhǎng)加速(圖1C)；第3天時(shí)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞鋪滿瓶底70%以上，部分區(qū)域細(xì)胞互相匯合無(wú)空隙，細(xì)胞形態(tài)以長(zhǎng)梭形、不規(guī)則多邊形為主(圖1D)。因消化后心臟組織內(nèi)多種細(xì)胞會(huì)混合生長(zhǎng)，部分區(qū)域細(xì)胞可見(jiàn)成簇生長(zhǎng)，呈扁平狀排列，可能為內(nèi)皮細(xì)胞。培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞中可見(jiàn)散在的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，折光性更強(qiáng)；有時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞搏動(dòng)，為心肌細(xì)胞(圖1B、圖1C及圖1D)，因心肌細(xì)胞為不可再生細(xì)胞，一般傳至第二代后則以成纖維細(xì)胞為主。

注： A～D分別為培養(yǎng)2、24、48及72 h。箭頭所示為心肌細(xì)胞。 圖1 原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(100×)Fig.1 The primary culture of cardiac fibroblasts at different time points under phase contrast microscope(100×)

2.2 心臟成纖維細(xì)胞純度

培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)vimentin 免疫組化染色后在倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)染為黃色，細(xì)胞核染為紫色，染色率達(dá)90%以上(圖2)，提示細(xì)胞純度較好。

2.3 培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞污染

本實(shí)驗(yàn)在原代細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)出現(xiàn)細(xì)菌污染(圖3A、B)，圖A顯示為支原體污染，菌體呈線狀或多形性，圖B顯示為黑蛟蟲(chóng)污染，呈黑點(diǎn)狀，培養(yǎng)基混濁，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，甚至裂解死亡。

3 討論

心臟主要由成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞等組成。心臟成纖維細(xì)胞是心臟纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞[7]心臟成纖維細(xì)胞的遷移及增殖能力極強(qiáng)，與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[8-10]，與多種心臟疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如高血壓性心肌肥厚、肥厚性心肌病、缺血性心肌病以及放射性心臟損傷等，故建立一種穩(wěn)定、有效的體外心臟成纖維細(xì)胞對(duì)臨床心血管疾病的研究、防治有著深遠(yuǎn)意義。

圖2 免疫組化檢測(cè)Vimentin在成纖維細(xì)胞表達(dá)(100×)Fig.2 Immunohistochemical detection of Vimentin expression in cardiac fibroblasts(100×)

注：圖A箭頭所示為支原體污染(臺(tái)盼藍(lán)染色)，圖B箭頭所示為黑蛟蟲(chóng)污染。圖3 原代培養(yǎng)48 h時(shí)細(xì)菌污染結(jié)果(100×)Fig.3 Bacterial contaminationat primary culture 48 h(100×)

目前關(guān)于心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法較多，大多都是從成年鼠或乳鼠心臟中分離培養(yǎng)[11-15]，也可從胚胎鼠心臟中分離培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞[16]，較為常用的是酶消化法及組織塊貼壁法。酶消化法包括單純胰蛋白酶消化[17-18]、消化過(guò)夜再用Ⅱ型膠原蛋白酶消化[19-20]以及蛋白酶混合Ⅰ型膠原酶聯(lián)合消化[14]。消化法是利用消化酶將基質(zhì)、纖維等消化去除，從而使細(xì)胞分離出來(lái)。胰蛋白酶主要作用是分解蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞膜破壞力強(qiáng)，消化細(xì)胞時(shí)若時(shí)間控制不好易造成細(xì)胞損傷。膠原酶以消化膠原為主，作用緩和。劉美麗等[21]取SD 成年大鼠心臟成纖維細(xì)胞，對(duì)不同消化酶組合及不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，最后發(fā)現(xiàn)單用膠原酶消化60 min 所得細(xì)胞數(shù)量最多，且細(xì)胞狀態(tài)佳、死亡率低、增值能力強(qiáng)等。

本研究在前期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用胰蛋白酶消化乳鼠心臟組織，消化時(shí)間較長(zhǎng)且不完全，提取細(xì)胞數(shù)量較少，消化后細(xì)胞活力差，生長(zhǎng)速度慢，提取的細(xì)胞貼壁后雜質(zhì)較多，傳代后細(xì)胞增值能力差且狀態(tài)不佳。主要因?yàn)橐鹊鞍酌赶瘯r(shí)間長(zhǎng)且消化不完全，對(duì)已消化的細(xì)胞破壞強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。后調(diào)整為胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶按1 ∶1混合置于37 ℃水浴箱中進(jìn)行短時(shí)間多次消化，所提取細(xì)胞量多，且細(xì)胞生長(zhǎng)快，約3～4 d時(shí)可生長(zhǎng)約90%，細(xì)胞雜質(zhì)少，傳代后生長(zhǎng)速度快，且細(xì)胞狀態(tài)好。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)菌操作、細(xì)胞貼壁時(shí)間長(zhǎng)短、細(xì)胞換液的頻率、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境也是影響原代成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)的重要條件。乳鼠生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)室安全級(jí)別達(dá)到要求，手術(shù)器械需要高壓滅菌，超凈臺(tái)需要紫外線照射及75%乙醇等提前消毒，乳鼠浸泡75%乙醇中時(shí)間約10 s為佳，取出的心臟組織需置于冰盒中PBS液中冰凍以減少心臟缺血缺氧損傷時(shí)間，冰凍的心臟組織清洗雜質(zhì)后盡快提取細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)過(guò)程污染與無(wú)菌操作不規(guī)范及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境相關(guān)。劉姿麟等[22]養(yǎng)大鼠血管平滑肌過(guò)程中出現(xiàn)霉菌污染?？傊诩?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中每一步均需嚴(yán)格遵照無(wú)菌操作流程。

本研究通過(guò)不斷反復(fù)實(shí)驗(yàn)及調(diào)整實(shí)驗(yàn)方法、條件等，通過(guò)觀察心臟成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)的第二代成纖維細(xì)胞并經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，證實(shí)本研究在實(shí)驗(yàn)室成功建立了一種穩(wěn)定、有效的原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。