鄭燕玲，張應(yīng)魏，鄧小彥

(1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，海南 海口 570000； 2.海南省老年病醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，海南 ?？?571100)

膿毒癥是因感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，膿毒癥發(fā)生過(guò)程中機(jī)體的先天性免疫系統(tǒng)被激活，使患者機(jī)體發(fā)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[1]；有研究表明，在疾病持續(xù)發(fā)展過(guò)程中機(jī)體的免疫功能會(huì)發(fā)生異常，因固有免疫細(xì)胞過(guò)度活化而出現(xiàn)炎癥反應(yīng)與細(xì)胞免疫功能紊亂及損害[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為內(nèi)源性基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，是直接由核苷酸酶DiceR剪切加工而成，其長(zhǎng)度為21～23個(gè)核苷酸[3]。研究顯示，miRNA與多種疾病發(fā)生、生理及病理過(guò)程密切相關(guān)，機(jī)體處于免疫功能異常或高炎癥刺激時(shí)miRNA表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常[4]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155、minRNA-466在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，可在一定程度中反映機(jī)體炎癥情況與免疫功能[5]。連續(xù)性腎臟替代治療(continuous renal repalccment therapy，CRRT)經(jīng)過(guò)連續(xù)清除患者血液中的毒素、中小分子物質(zhì)及致病介質(zhì)來(lái)保障機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡，對(duì)膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)與機(jī)體免疫應(yīng)答具有調(diào)節(jié)作用，但目前CRRT對(duì)膿毒癥患者外周血microRNA-155、microRNA-466表達(dá)的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)42例膿毒癥患者進(jìn)行CRRT治療，觀察治療后患者外周血miRNA-155、minRNA-466的表達(dá)變化，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月-2019年2月收治的膿毒癥患者80例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組(42例)與對(duì)照組(38例)。所有入選患者符合《2001年國(guó)際膿毒癥定義會(huì)議關(guān)于膿毒癥診斷的新標(biāo)準(zhǔn)》[6]中膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡65～74歲；排除既往進(jìn)行過(guò)腎移植手術(shù)者、確診為終末期腎臟疾病者，排除已明確或疑似腎臟性疾病及低血容量性休克患者。觀察組男28例、女14例，平均(72.32±2.21)歲，急性生理與慢性健康(acute physiology and chronic healthevaluation，APACHE Ⅱ)評(píng)分(22.17±7.20)分，全身性感染相關(guān)性器官功能衰竭評(píng)分(sequential organ failure assessment，SOFA)評(píng)分(10.52±2.75)分；對(duì)照組男26例、女12例，平均年齡(72.18±2.19)歲，APACHE Ⅱ評(píng)分(22.35±8.18)分，SOFA評(píng)分(10.21±2.62)分，2組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；本研究所有入選患者均為自愿參與，且簽署知情同意書(shū)；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

對(duì)照組患者根據(jù)國(guó)際膿毒癥和膿毒癥休克指南，采用對(duì)癥、抗炎、抑菌及補(bǔ)液等治療，4周為1個(gè)療程；觀察組患者在對(duì)照組治療的基礎(chǔ)上加用CRRT治療，以連續(xù)性靜脈-靜脈血液濾過(guò)模式，患者血流量保持100～160 mL/min，具體的CRRT清除率與超濾量按照個(gè)體現(xiàn)狀來(lái)確定，治療持續(xù)48 h，2次/周(間隔時(shí)間至少24 h)，4 周為1個(gè)療程。

1.3 觀察指標(biāo)

比較2組患者治療前及治療4周時(shí)的APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分、外周血免疫指標(biāo)[CD4+、CD8+、CD14+單核細(xì)胞人類(lèi)白細(xì)胞抗原DR(monocyte human leukocyte antigen，DRHLA-DR)]、炎癥因子 [降鈣素原(PCT)、白細(xì)胞介素-23(IL-23)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)]、miRNA-155及miRNA-466水平。(1)APACHE Ⅱ評(píng)分[7]及SOFA評(píng)分[8]：APACHE Ⅱ評(píng)分總分為71分，得分越高則提示患者不良預(yù)后越嚴(yán)重； SOFA評(píng)分總共評(píng)估6個(gè)系統(tǒng)，評(píng)分為0～4分，取得的分?jǐn)?shù)越高則其器官損傷及不良預(yù)后越嚴(yán)重。(2)治療前及治療4周時(shí)抽取患者外周靜脈血5 mL，采用流式細(xì)胞儀(型號(hào)FACScan，賽默飛世爾科技)檢測(cè)CD4+、CD8+、DRHLA-DR，免疫發(fā)光夾心法檢測(cè)PCT含量，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-23含量，，酶速率散射比濁法檢測(cè)CRP含量。(3)采用TRIzol一步法提取總RNA，操作步驟根據(jù)美國(guó)Invitrogen公司TRIzol試劑盒說(shuō)明，總RNA的吸光度值采用紫外分光光度計(jì)(型號(hào)UV-5200，上海儀電分析儀器有限公司)測(cè)定，引物為上海生工生物工程股份有限公司合成，反應(yīng)總體積25 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 15 min，95 ℃ 15 s、70 ℃ 90 s、60 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)，miRNA-155及miRNA-466相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 APACHE ⅡI及SOFA評(píng)分

治療前，2組患者APACHE Ⅱ、SOFA評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，2組患者APACHE Ⅱ、SOFA評(píng)分較治療前顯著降低(P<0.05)，觀察組患者APACHE Ⅱ、SOFA評(píng)分低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者治療前及治療4周時(shí)APACHE Ⅱ及SOFA評(píng)分Tab.1 Comparison of APACHE Ⅱ and SOFA scores before and after treatment in both groups

注：(1)與同組治療前比較，P<0.05;(2)與對(duì)照組治療4周時(shí)比較，P<0.05。

2.2 外周血免疫學(xué)指標(biāo)

治療前，2組患者CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、DRHLA-DR百分比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，2組患者CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、DRHLA-DR百分比較治療前顯著升高(P<0.05)，觀察組患者CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、DRHLA-DR百分比顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者治療前及治療4周時(shí)部分外周血免疫學(xué)指標(biāo)/%Tab.2 Comparison of peripheral blood immune indexes before and after treatment in both groups/%

注：(1)與同組治療前比較，P<0.05;(2)與對(duì)照組治療4周時(shí)比較，P<0.05。

2.3 炎癥因子

兩組患者治療前及治療4周時(shí)結(jié)果比較，治療前，2組患者血清PCT、IL-23及CRP水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，2組患者血清PCT、IL-23及CRP水平較治療前顯著降低(P<0.05)，觀察組患者血清PCT、IL-23及CRP水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者治療前及治療4周時(shí)部分炎癥因子水平/(ng/L)Tab.3 Comparison of inflammatory factors levels before and after treatment in both groups/(ng/L)

注：(1)與同組治療前比較，P<0.05;(2)與對(duì)照組治療4周時(shí)比較，P<0.05。

2.4 miRNA-155及miRNA-466表達(dá)水平

治療前，2組患者外周血miRNA-155、miRNA-466表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，2組患者外周血miRNA-155、miRNA-466表達(dá)水平較治療前顯著降低(P<0.05)，觀察組患者外周血miRNA-155、miRNA-466表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組患者治療前及治療4周時(shí)外周血miRNA-155及miRNA-466表達(dá)水平Tab.4 Comparison of miRNA-155 and miRNA-466 expression before and after treatment in both groups

注：(1)與同組治療前比較，P<0.05;(2)與對(duì)照組治療4周時(shí)的比較，P<0.05。

3 討論

CRRT可清除膿毒癥患者中小分子溶質(zhì)、與膿毒癥相關(guān)的炎癥因子、調(diào)節(jié)電解質(zhì)與酸堿平衡紊亂，同時(shí)可在穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)中作用于免疫應(yīng)答失衡，降低對(duì)臟器的損傷，保證內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性[9-10]。有研究報(bào)道，膿毒癥患者無(wú)論是否發(fā)生急性腎功能損傷，皆可在集束化治療基礎(chǔ)中聯(lián)合CRRT治療[11]。

APACHE Ⅱ、SOFA評(píng)分作為目前國(guó)際中應(yīng)用于危重學(xué)科的評(píng)分系統(tǒng)，其評(píng)分結(jié)果與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，尤其在膿毒癥患者的病情分類(lèi)與預(yù)后判斷中廣泛應(yīng)用[12]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，治療后2組APACHE Ⅱ、SOFA評(píng)分較治療前顯著下降；且觀察組APACHE Ⅱ、SOFA評(píng)分下降更顯著，提示治療后患者病情得到改善。有研究報(bào)道，膿毒癥患者機(jī)體常因CD8+T細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞內(nèi)病原體的“繼發(fā)性”高度敏感。在外源性導(dǎo)致的敏感源中，CD8+T細(xì)胞經(jīng)特異性識(shí)別經(jīng)MHC I類(lèi)分子提呈的內(nèi)源性抗原肽，從而清除病原體感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，在感染與腫瘤免疫中至關(guān)重要[13]。此外，CD14+單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)、CD4+T等均參與了膿毒癥患者免疫功能的調(diào)控，DRHLA-DR作為單核巨噬細(xì)胞表層中分泌的抗原，是構(gòu)成單核巨噬細(xì)胞提成外來(lái)抗原的首要分析，HLA-DR可把單核巨噬細(xì)胞吞噬同時(shí)將抗原傳遞到CD4+、CD8+T輔助細(xì)胞，從而活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，所以HLA-DR水平對(duì)免疫功能具有重要作用[14]。膿毒癥患者的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞、患者的機(jī)體免疫狀態(tài)較差，CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的變化基本可以反應(yīng)膿毒癥患者的細(xì)胞免疫狀況，本研究中，治療后2組患者CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞、DRHLA-DR百分比較治療前升高，觀察組升高更顯著，提示在采用CRRT治療后患者CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞有不同程度的恢復(fù)，CRRT對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能具有調(diào)節(jié)作用，上調(diào)血清T淋巴細(xì)胞亞群水平，提高患者免疫功能。

研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能失調(diào)會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)與細(xì)胞免疫功能紊亂及損害，細(xì)胞因子PCT、IL-23及CRP水平會(huì)由于機(jī)體免疫功能的下降而升高[15-18]。PCT是降鈣素的前體，在機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，PCT呈現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)在內(nèi)毒素刺激3～4 h，PCT水平會(huì)在8～24 h達(dá)到高峰，是目前臨床應(yīng)用評(píng)估重癥患者感染的標(biāo)志物，可有效監(jiān)測(cè)膿毒癥變化。IL-23作為異源性二聚體蛋白，具有多元化的生物學(xué)作用，能夠分化成熟的T淋巴細(xì)胞加快其分泌，在膿毒癥患者IL-23水平顯著高于健康者[19]。CRP主要來(lái)源于肝臟分泌合成，在機(jī)體受?chē)?yán)重侵損與感染時(shí)呈現(xiàn)為高表達(dá)，尤其在炎癥應(yīng)答4～6 h內(nèi)，CRP短時(shí)間中呈現(xiàn)為高表達(dá)且在36～50 h內(nèi)水平達(dá)到臨界值[20]，有研究表明，膿毒癥患者血清CRP水平與健康群體比較顯著較高[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者治療前PCT、IL-23及CRP水平呈現(xiàn)高表達(dá)，在治療后顯著降低，且采用CRRT治療的觀察組下降更顯著，進(jìn)一步提示CRRT治療可顯著抑制膿毒癥患者炎癥因子表達(dá)水平來(lái)阻止病情進(jìn)一步惡化。miRNA在機(jī)體處于高炎癥狀態(tài)與低免疫功能時(shí)表達(dá)情況異常[22]。近年來(lái)關(guān)于膿毒癥相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155是感染患者炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)的平衡點(diǎn)，全程參與病理生理階段，可作為評(píng)估疾病發(fā)展的特異性指標(biāo)[23]。mircroRNA-466同樣作為參與感染患者病情發(fā)展的分子標(biāo)志物，廣泛分布于組織與體液中，在感染患者中miRNA-466異常表達(dá)，mircroRNA-466還可能與急性反應(yīng)相關(guān)，同時(shí)參與轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-KBI的調(diào)控，可能由于其可加快脂質(zhì)介質(zhì)蛋白表達(dá)，而凋亡的中性粒細(xì)胞可在脂質(zhì)介質(zhì)蛋白作用于被巨噬細(xì)胞攝取來(lái)達(dá)到降低炎癥反應(yīng)的作用[24]。此外，還有研究學(xué)說(shuō)認(rèn)為miRNA-466作用于PIK3、MAPK傳導(dǎo)信號(hào)激活通路，引起細(xì)胞因子風(fēng)暴進(jìn)一步導(dǎo)致膿毒癥患者發(fā)生感染性休克與多器官衰竭[25]。本研究結(jié)果顯示治療前miRNA-155、miRNA-466受高CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞、DRHLA-DR免疫水平與高PCT、IL-23、CRP等炎癥因子水平的影響而升高，在CRRT治療后機(jī)體免疫水平與炎癥因子下調(diào)，而miRNA-155、miRNA-466表達(dá)下降，提示CRRT治療可影響膿毒癥患者外周血miRNA-155、miRNA-466的表達(dá)。

綜上所述，CRRT可調(diào)控CD4+、CD14+HLA-DR、CD8+水平，減輕PCT、IL-23、CRP炎癥因子與miRNA-155和miRNA-155表達(dá)。但由于本研究為小樣本研究，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本的多中心研究中驗(yàn)證，以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。