徐銀琴，王光義*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 針灸科，貴州 貴陽 550004)

椎間盤退變被認(rèn)為是引起頸、腰椎病疼痛的主要原因，而頸腰痛是目前臨床最常見的頸椎病和腰椎病的就診原因，每年醫(yī)療費(fèi)用巨大[1]。椎間盤退變是由衰老、異常應(yīng)力、損傷等多種因素引起的椎間盤慢性退行性病變，其病理過程往往伴隨著細(xì)胞減少、細(xì)胞外基質(zhì)丟失、Ⅰ型膠原大量合成等，最終導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變[2]。有研究指出，椎間盤細(xì)胞過度凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量減少和細(xì)胞活力喪失可直接影響椎間盤的功能[3]。因此，能否有效抑制椎間盤細(xì)胞凋亡、改善椎間盤功能成為臨床治療椎間盤退行性疾病新的攻破點(diǎn)。中藥熱奄包作為一種中醫(yī)保守療法，藥物在熱力作用下可直接滲透至病灶深部，有疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀、緩解疼痛及減輕炎癥的作用[4]。天冬氨酸特異性蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific protease-3，caspase-3)是半胱氨酸蛋白酶家族的成員，與細(xì)胞凋亡有著密不可分的關(guān)系，可通過降解細(xì)胞內(nèi)底物激活細(xì)胞凋亡通路，致使細(xì)胞凋亡[5]。B淋巴細(xì)胞瘤-2(B lymphocytoma-2，Bcl-2)是Bcl-2家族主要的抗凋亡蛋白，可抑制細(xì)胞色素C釋放, 阻止下游胱冬肽酶的激活, 從而起到抑制凋亡發(fā)生的作用[6]。因此，本研究通過建立新西蘭大白兔頸椎間盤退變模型，探討中藥熱奄包外敷療法對(duì)退變椎間盤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Bcl-2 mRNA的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要藥品、試劑及儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)新西蘭大白兔[SYXK(黔)2018-0001]18只，雌雄各半，每只體質(zhì)量2.0～2.5 Kg，貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2主要藥品與試劑 通痹方(葛根20 g、桂枝12 g、伸筋草10 g、牛膝10 g、路路通10 g、細(xì)辛10 g、防風(fēng)10 g、川芎15 g、紅花10 g、沒藥20 g、赤芍15 g、獨(dú)活15 g、威靈仙15 g及秦艽15 g)為貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院針灸科自制方，中藥材均購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；TRIZOL試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色液購(gòu)自湖南艾佳生物有限公司，引物由中國(guó)生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.1.3主要儀器 1730R高速冷凍離心機(jī)(香港基因有限公司)、YB-6LF生物組織石蠟包埋機(jī)(孝感亞光醫(yī)用技術(shù)有限公司)、YT-6C生物組織攤烤片機(jī)(孝感亞光醫(yī)用技術(shù)有限公司)、AE41光學(xué)顯微鏡(廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司)和7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1造模及分組 18只家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為空白組、模型組及熱敷組，每組各6只。模型組和熱敷組家兔采用長(zhǎng)期低頭位建模法建立頸椎病家兔模型[7]，即將家兔置于兔固定盒內(nèi)，充分顯露頸部，敷以保濕冰袋，使其頸部成低頭屈曲位45°、3 h/次、2次/d，造模30 d后拍攝頸椎X線片，見家兔頸椎出現(xiàn)生理曲度改變、反弓或椎間隙變窄、椎間孔變小、椎體出現(xiàn)骨質(zhì)增生或椎體周圍軟組織鈣化等變化中的2項(xiàng)時(shí)即視為造模成功?？瞻捉M同期正常飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)；模型組僅作造模處理，不予任何治療；熱敷組造模成功后用通痹方方藥制成熱奄包，加水煎熬后去除藥包多余水分，將溫度適宜的熱奄包置于家兔頸部進(jìn)行熱敷，1次/d、15 min/次，治療5次，休息2 d，共治療15次。

1.2.2頸椎影像學(xué)觀察及評(píng)分 各組家兔在造模前、造模第30天及治療結(jié)束后拍攝頸椎左側(cè)位X線，觀察頸椎病變情況，并參照文獻(xiàn)[8]方法以造模前X線檢查作參照，于造模第30天、治療結(jié)束后2個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)頸椎椎間隙、椎體前后緣、頸椎上下關(guān)節(jié)突骨質(zhì)增生情況、椎間孔、頸椎生理曲度進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算治療后X線積分改善程度(治療后X線積分改善程度=造模后X線積分-治療后X線積分)。

1.2.3頸椎間盤組織形態(tài)學(xué)觀察及評(píng)分 于治療結(jié)束后第2天取出各組家兔C3-4椎間盤在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，4 ℃冰箱過夜，0.9%生理鹽水浸洗2～3次，置于10%EDTANa2溶液脫鈣，經(jīng)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，參照文獻(xiàn)[9]方法對(duì)椎間盤組織形態(tài)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分范圍從正常椎間盤4分到嚴(yán)重退變椎間盤12分。

1.2.4椎間盤Caspase-3和Bcl-2 mRNA 采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time Quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測(cè)。取各組家兔C4-5椎間盤液氮研磨后用Trizol法提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL:SYBR Mix 5 μL，引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)參數(shù)為50 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔCt法計(jì)算Caspase-3和Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 相關(guān)引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 頸椎X線評(píng)分

與空白組相比，模型組和熱敷組家兔造模后頸椎X線評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；熱敷組家兔治療后頸椎X線積分改善程度較模型組大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組家兔頸椎X線評(píng)分和積分改善程度比較Tab.2 The effect of tongbi hot compress on X-ray imaging scores and score improvement of rabbits' cervical spine in the different

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

2.2 C3-4椎間盤組織結(jié)構(gòu)

HE染色結(jié)果顯示，空白組家兔C3-4椎間盤纖維環(huán)層次分明、排列整齊、結(jié)構(gòu)正常、細(xì)胞分布均勻，模型組家兔椎間盤纖維環(huán)可見纖維排列松散紊亂、出現(xiàn)較多撕裂和細(xì)胞腫脹變性，熱敷組家兔椎間盤纖維環(huán)排列相對(duì)整齊、層次相對(duì)清楚和細(xì)胞形態(tài)稍好；模型組家兔椎間盤評(píng)分比空白組升高，熱敷組評(píng)分比模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。圖1 各組家兔C3-4椎間盤纖維環(huán)組織學(xué)及HE染色評(píng)分Fig.1 The effect of tongbi hot compress on histology of C3-4 intervertebral disc annulus in the different groups

2.3 C4-5椎間盤Caspase-3和Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

與空白組相比，模型組家兔C4-5椎間盤內(nèi)Casepase-3 mRNA表達(dá)升高、Bcl-2 mRNA表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，熱敷組家兔椎間盤內(nèi)Casepase-3 mRNA表達(dá)降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組家兔椎間盤Caspase-3和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比Tab.3 The effect of tongbi hot compress on Caspase-3 and Bcl-2 mRNA in C4-5 intervertebral discs in the different groups

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

3 討論

椎間盤由中心的髓核、包裹于髓核周圍的纖維環(huán)以及上下端的軟骨終板構(gòu)成[10]，位于上下兩椎體之間，起到緩沖震蕩、均勻分散脊柱應(yīng)力、連接椎體及維持脊柱高度的作用，是人體最容易發(fā)生退變的組織[11]。導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退變的因素眾多，常見的有機(jī)械壓力、創(chuàng)傷、免疫因素以及缺血缺氧等均可誘使椎間盤過早的發(fā)生退變[12]。本研究使用低頭位造模法經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)之后建立家兔頸椎間盤退變模型，較好的模擬人類長(zhǎng)期低頭頸椎異常應(yīng)力所致頸椎間盤退變，且兔頸椎結(jié)構(gòu)與人類頸椎結(jié)構(gòu)極為相似，這使得研究所用模型更符合臨床實(shí)際。建立模型后，本研究觀察到家兔頸椎X線出現(xiàn)了不同程度的椎間隙狹窄、曲度變直，椎體邊緣觀察到骨贅形成，小關(guān)節(jié)出現(xiàn)增生硬化等情況，說明模型建立成功。在對(duì)家兔頸椎X線的評(píng)分中，與空白組相比，模型組和熱敷組家兔造模后頸椎X線評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；熱敷組家兔治療后頸椎X線積分改善程度較模型組大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；椎間盤HE染色顯示，空白組家兔椎間盤纖維環(huán)層次分明、排列整齊、結(jié)構(gòu)正常、細(xì)胞分布均勻，模型組家兔椎間盤纖維環(huán)可見纖維排列松散紊亂，出現(xiàn)較多撕裂和細(xì)胞腫脹變性，熱敷組家兔椎間盤纖維環(huán)排列相對(duì)整齊、層次相對(duì)清楚和細(xì)胞形態(tài)稍好；模型組家兔椎間盤評(píng)分比空白組升高，熱敷組評(píng)分比模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果提示建模過程中家兔的不當(dāng)體位以及異常應(yīng)力致使家兔頸椎椎間盤發(fā)生退變，經(jīng)過通痹方外敷治療后從影像學(xué)上家兔頸椎整體退變情況較前好轉(zhuǎn)，從組織形態(tài)學(xué)上椎間盤退變程度也較治療前減輕。

細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞自主性死亡，存在于機(jī)體的整個(gè)生命過程維持機(jī)體器官或組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13]，對(duì)機(jī)體的免疫和防御反應(yīng)、疾病或中毒引起的細(xì)胞損傷等都具有非常重要的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡異常與椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡異常增多導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞活性降低、活性細(xì)胞數(shù)量減少，加重了椎間盤退變過程[15]。研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞凋亡異常增加, 會(huì)導(dǎo)致椎間盤內(nèi)的活化軟骨細(xì)胞數(shù)量減少, 軟骨細(xì)胞合成和(或)降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力降低,致使代謝產(chǎn)物堆積于椎間盤內(nèi),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)減少,最終導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退變[16]。同樣有很多研究者認(rèn)為，細(xì)胞凋亡過度或衰老會(huì)引起的椎間盤髓核細(xì)胞數(shù)目減少和細(xì)胞活性降低，細(xì)胞外基質(zhì)合成減少而分解增加是導(dǎo)致椎間盤退變的主要原因[17]。也有研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的纖維環(huán)細(xì)胞減少是纖維環(huán)退變的主要原因，而椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞減少，細(xì)胞外基質(zhì)成分也不斷減少，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退變[18]。總而言之，細(xì)胞凋亡是椎間盤退變的重要環(huán)節(jié)，椎間盤細(xì)胞過度凋亡后導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞活性降低以及細(xì)胞外基質(zhì)成分合成減少，是促進(jìn)椎間盤退變和衰老主要因素。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡通路的中心環(huán)節(jié)，Caspase-3作為Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，在死亡受體途徑與線粒體凋亡途徑等途徑中介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡[5]。在正常情況下, 胞質(zhì)中的Caspase-3以無活性的酶原形式存在，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C激活天冬氨酸特異性蛋白酶-9(cysteine-containing aspartate-specific protease-9，Caspase-9)，繼而激活Caspase-3[19]；被活化后的Caspase-3直接參與切割或降解細(xì)胞的多種結(jié)構(gòu)和功能蛋白，引起細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞凋亡[20]。對(duì)人退變腰椎間盤的研究表明，腰椎間盤退行性病變患者血清中Caspase-3和Caspase-9的濃度明顯高于正常健康者，而且Caspase-3、Caspase-9的濃度與腰椎間盤突出節(jié)段的數(shù)量有直接聯(lián)系，指出凋亡因子Caspase-3和Caspase-9腰椎間盤退變的發(fā)生或發(fā)展過程中起到重要作用[21]。在線粒體凋亡通路上Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的調(diào)控者，以線粒體為調(diào)控凋亡單位，Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bcl-2家族蛋白Bax為促凋亡蛋白，當(dāng)Bcl-2表達(dá)降低、Bax表達(dá)升高時(shí)，線粒體通道開放釋放出細(xì)胞色素C等誘導(dǎo)凋亡因子啟動(dòng)下游凋亡發(fā)生[22]。Bcl-2是線粒體凋亡途徑上最重要的抗凋亡因子，通過減少凋亡誘導(dǎo)因子、與促凋亡因子Bax 結(jié)合、拮抗凋亡蛋白酶等發(fā)揮抑制凋亡作用[23]。有研究報(bào)道，Bcl-2可抑制線粒體中內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶及細(xì)胞色素C的釋放，干預(yù)Caspase-3活化進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡的作用，認(rèn)為Bcl-2可能抑制了Caspase-3 的合成[6]。有人在對(duì)人類退變椎間盤的研究中發(fā)現(xiàn)，在椎間盤退行性變程度逐漸加重的過程中，髓核組織中的Bax和Casepase-3表達(dá)量也呈現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì)，Bcl-2則趨于下降[24]，這說明椎間盤退行性變程度越重，髓核細(xì)胞的凋亡水平越高。周文明等[10]用補(bǔ)腎壯督方對(duì)椎間盤退變模型大鼠干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)干預(yù)后大鼠退變椎間盤中活化Caspase-3表達(dá)量明顯下降，Bcl-2表達(dá)量明顯增加。同以上研究結(jié)果一致，本次研究結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組家兔椎間盤內(nèi)Casepase-3 mRNA表達(dá)升高、Bcl-2 mRNA表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，熱敷組Casepase-3 mRNA表達(dá)較模型組降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)較模型組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示造模后家兔退變頸椎間盤內(nèi)細(xì)胞凋亡增多，而在治療后，與模型組相比較，熱敷組Casepase-3表達(dá)降低、Bcl-2表達(dá)升高則說明經(jīng)通痹方熱奄包外敷治療后椎間盤內(nèi)細(xì)胞凋亡較前減少。

在既往的研究中研究者用中藥熱奄包對(duì)腰椎間盤突出癥患者進(jìn)行熱敷治療后，患者腰骶部疼痛及下肢麻木癥狀明顯緩解[25]。有臨床研究采用中藥熱奄包聯(lián)合手法治療腰椎間盤突出癥患者總有效率達(dá)92.5%，VAS評(píng)分較治療前顯著降低[4]。本研究所用通痹方為自擬方，在臨床應(yīng)用10余年，口諭頗佳。全方以紅花、赤芍、獨(dú)活、威靈仙、防風(fēng)、細(xì)辛等祛風(fēng)除濕、舒筋通絡(luò)、活血止痛為主，輔以川芎、桂枝、葛根溫通經(jīng)脈、通達(dá)氣血，全方合用具有溫經(jīng)通絡(luò)止痛、調(diào)和氣血、祛濕除寒的作用，主要治療以頸椎病、腰椎病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等為主的痹證[26]。用此方制成熱奄包對(duì)疼痛局部進(jìn)行熱敷可使藥效滲透到病變局部，起到溫經(jīng)散寒、活血通絡(luò)止痛的作用，且溫?zé)岬乃幬镏苯幼饔糜诰植靠纱龠M(jìn)經(jīng)脈氣血運(yùn)行、扶正祛邪，能有效改善患者局部畏寒、疼痛不適等情況。

綜上所述，通痹方熱奄包外敷治療可導(dǎo)致抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)上調(diào)和凋亡執(zhí)行因子Caspase-3的表達(dá)下調(diào)，從而減少椎間盤細(xì)胞凋亡，改善椎間盤退變程度。