謝鵬, 任真奎, 呂菊, 胡玉梅, 吳昌學(xué)*, 禹文峰*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004； 3.黔西南州人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 興義 562400)

缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的主要病因，研究表明，缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞損傷可能是由于缺血和再灌注階段引起的神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、過度自噬激活、細(xì)胞能量耗竭和氨基酸興奮性中毒等原因造成的[1-2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞器，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的生物合成、折疊修飾以及運(yùn)輸?shù)萚3]，蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的合成和正確折疊對細(xì)胞的存活以及蛋白質(zhì)發(fā)揮正確功能是至關(guān)重要的。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)被打破時(shí)，會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，也稱折疊蛋白反應(yīng)，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的生存[4]。研究表明，缺血再灌注會觸發(fā)機(jī)體細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，但持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5-6]。因此，以缺血再灌注導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為腦卒中的治療靶點(diǎn)的研究受到越來越多的關(guān)注。α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,α-LA)是一個(gè)短鏈脂肪酸，是機(jī)體內(nèi)諸多重要酶的輔助因子，也是萬能的抗氧化劑，參與了很多細(xì)胞內(nèi)的重要代謝過程[7-8]。有研究報(bào)道，α-LA在MCAO大鼠模型上通過mTOR信號通路降低大腦的缺血再灌注損傷[9]，在人的肝移植研究中發(fā)現(xiàn)α-LA可以改善肝移植的再灌注后綜合征[10]?？梢?，α-LA在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著有效的保護(hù)作用，其深入的分子機(jī)制理論需要更多的證據(jù)支持。因此，本研究利用體外氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)的大鼠腎上腺嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)模型，探討缺血再灌注誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的分子機(jī)制以及α-LA對缺血再灌注細(xì)胞模型的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

PC12細(xì)胞系購買自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰酶消化液購至美國Gibco公司，1×磷酸鹽緩沖液(1×PBS)購至以色列Biological Industries，蛋白酶抑制劑(PMSF)、兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、兔抗裂解型胱天蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)和抗兔二抗購至美國CST，環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)購至Absion，兔抗B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X (Bax)購至美國Abcam，細(xì)胞活性檢測試劑盒-8(CCK-8試劑盒)購至日本同仁，ECL-Plus化學(xué)發(fā)光液和PVDF膜購買至美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng)及缺血再灌注模型建立 高分化的PC12細(xì)胞用1%雙抗+10%FBS +89%DMEM培養(yǎng)基配方進(jìn)行培養(yǎng)，長至80%～90%密度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。以每孔2×105的細(xì)胞密度接種在六孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行缺血再灌注模型建立。合適密度的細(xì)胞吸棄原培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩遍后加無糖培養(yǎng)基(不含血清)2 mL，置于三氣培養(yǎng)箱(37 ℃，1%O2+94%N2+5%CO2)進(jìn)行OGD處理，OGD 4 h后棄原培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞兩遍加高糖培養(yǎng)基(不含血清)2m L置于正常培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)行復(fù)氧糖處理以模擬再灌注，再灌注不同時(shí)間段(0、6、12、18和24 h)后進(jìn)行后續(xù)干預(yù)處理。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)分為正常組(Control)、OGD 4 h組(OGD4)、OGD 4 h后復(fù)氧不同時(shí)間段4組(OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18、OGD4+R24)、α-硫辛酸給藥OGD/R組(OGD/R+α-LA)。Control組細(xì)胞在完全培養(yǎng)基、正常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，OGD/R組細(xì)胞按上述方法進(jìn)行培養(yǎng)處理，OGD/R+α-LA組細(xì)胞先OGD處理后在復(fù)氧時(shí)給予不同濃度(0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 mmol/L)α-LA共同處理細(xì)胞24 h。

1.2.3CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的存活率 生長至合適密度的細(xì)胞，將細(xì)胞以每孔5×103的密度接種至96孔板，長到50%～60%密度時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔分別加入無糖DMEM培養(yǎng)基100 μL，置于三氣培養(yǎng)箱(1%O2+5%CO2+95%N2)中培養(yǎng)4 h模擬缺血缺氧處理。缺氧處理后用高糖無血清培養(yǎng)基配置含不同濃度(0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 mmol/L) α-LA的培養(yǎng)基置于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h行復(fù)氧處理。復(fù)氧24 h后，每孔加入CCK-8 10 μL工作液反應(yīng)1 h，以空白孔調(diào)零，每組六個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)測定儀測定450 nm波長下的吸光度值(OD)。細(xì)胞存活率=(OD給藥-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.2.4檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)分子GRP78、CHOP、Bax及Cleaved-caspase3表達(dá) 各組細(xì)胞分別接種于六孔板內(nèi)，長到合適密度后經(jīng)過干預(yù)處理，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞兩遍，盡量吸棄PBS后按每孔120 μL的量加裂解液(RIPA)置于冰上，裂解細(xì)胞5 min后，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞至1.5 mL干凈離心管中，置于冰上繼續(xù)裂解20 min后，12 000 r/min離心收集上清至新的干凈1.5 mL離心管，BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，5×SDS buffer，100 ℃，5～10 min變性蛋白后，按每孔30 μg等量上樣30 mA恒流電泳分離蛋白，220 mA恒流轉(zhuǎn)膜120 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉室溫封閉膜1.5 h，PBST洗膜5 min后孵育一抗，4 ℃搖床過夜；次日，1×TBST每10 min洗膜3次,室溫孵育二抗2 h，TBST每10 min洗膜3次，ECL-Plus發(fā)光液于GeneGnome XRQ曝光，β-actin作為內(nèi)參，ImageJ軟件進(jìn)行蛋白定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞GRP78、CHOP、Bax和Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)

與Control組比較，OGD4、OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18、OGD4+R24組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的分子GRP78和CHOP表達(dá)逐漸升高(P<0.05)，其中GOGD4+R24升高最明顯(P<0.05)；同時(shí)相關(guān)的凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3表達(dá)也逐漸升高(P<0.05)，在OGD4+R24組升高最高(P<0.05)。見圖1。

注：A為蛋白免疫印跡法條帶；B為各蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖； (1)與control組比較，P<0.05。圖1 各組PC12細(xì)胞GRP78、CHOP、Bax和Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression levels of GRP78, CHOP, Bax and Cleaved-caspase 3 in the different groups

2.2 α-LA 對OGD/R處理后PC12細(xì)胞存活率的影響

與Control組比較，OGD4+R24組PC12細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。與OGD4+R24組比較，OGD/R+α-LA組除0.01 mmol/L α-LA濃度外，其余濃度α-LA 下的PC12細(xì)胞存活率均升高(P<0.05)；當(dāng)α-LA 濃度為0.50 mmol/L時(shí)PC12細(xì)胞存活率最高(P<0.05)。當(dāng)α-LA濃度為10.00 mmol/L時(shí)，PC12細(xì)胞的存活率較OGD4+R24組明顯降低(P<0.05)，表明α-LA在此工作濃度下對PC12具有較強(qiáng)的毒性。見圖2。

注： (1)與control組比較，P<0.05；(2)與OGD4+R24組比較，P<0.05。圖2 各組PC12細(xì)胞的存活率Fig.2 Comparison of cell survival rates in the different groups

2.3 α-LA 對OGD/R處理后PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved-caspase3表達(dá)的影響

與Control組比較，OGD4+R24組的細(xì)胞凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與OGD4+R24組比較，OGD/R+α-LA(0.5 mmol/L)組凋亡分子Bax和Cleaved-caspase3的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖3。

注：A為Western blot條帶圖，B為相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖；(1)與control組比較P<0.05；(2)與OGD4+R24組比較，P<0.05。圖3 α-LA對缺血再灌注后PC12細(xì)胞凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3表達(dá)的影響Fig.3 The effect of α-LA on OGD/R-mediated expression levels of Bax and Cleaved-caspase 3

2.4 α-LA降低缺血再灌注誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78和CHOP表達(dá)

與Control組比較，OGD4+R24組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78和CHOP的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；OGD/R+α-LA(0.5 mmol/L)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78和CHOP的表達(dá)明顯減少(P<0.05)。見圖4。

注：A為Western blot條帶圖，B為相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖；(1)與control組比較，P<0.05；(2)與OGD4+R24組比較，P<0.05。圖4 α-LA對缺血再灌注后PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP表達(dá)的影響Fig.4 The effect of α-LA on the expression levels of OGD4/R-mediated GRP78 and CHOP

3 討論

心腦血管疾病嚴(yán)重威脅人類生命安全，影響人類生活質(zhì)量，其中腦卒中是全球排名第二的死亡原因。腦血管破裂及阻塞所導(dǎo)致缺血再灌注損傷是腦卒中發(fā)病的主要原因。缺血再灌注損傷復(fù)雜的病理分子機(jī)制為腦卒中的預(yù)防及治療帶來了困難，研究缺血再灌注損傷的分子機(jī)制及開發(fā)有效的藥物干預(yù)治療靶點(diǎn)具有重要意義。OGD/R模型是體外模擬缺血再灌注損傷的經(jīng)典模型，是缺血再灌注損傷分子機(jī)制研究、藥物藥效、藥理及藥動學(xué)的經(jīng)典研究模型。PC12細(xì)胞因其神經(jīng)元和腫瘤無限增殖傳代的特性，故而成為體外研究缺血再灌注損傷分子機(jī)制及藥物藥效學(xué)研究的重要載體。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是生物有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，其主要的功能是合成蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)修飾折疊加工、脂質(zhì)的生物合成等[11-13]。其自然進(jìn)化而來的適應(yīng)系統(tǒng)—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，對維持細(xì)胞的正常存活以及發(fā)揮正常生物學(xué)功能是至關(guān)重要的[14-15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與許多的生理病理過程[16-17]。有研究證實(shí)，缺血再灌注誘導(dǎo)的鈣離子升高、ROS釋放、能量耗竭等病理過程都會促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[18-20]。過度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)會加劇缺血再灌注損傷對神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及腎細(xì)胞等損害作用[21-22]。因此，尋找有效的藥物干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可能是腦卒中、心肌梗死等疾病的有效治療策略。

α-LA是萬能的抗氧化劑。諸多研究證實(shí)，α-LA在糖尿病、糖尿病并發(fā)類神經(jīng)疾病中發(fā)揮著積極保護(hù)的作用[23- 24]。本課題組前期的研究結(jié)果顯示，α-LA能有效降低6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活性下降[25]。為探討其對缺血再灌注損傷作用的保護(hù)機(jī)制，本研究進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究運(yùn)用高度誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞OGD 4 h再灌注不同時(shí)間段觀察缺血再灌注對PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響。有趣的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與正常組比較，缺血再灌注的不同時(shí)間段誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡水平的同步持續(xù)升高。表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的分子GRP78和CHOP的表達(dá)逐步增加，凋亡相關(guān)分子Bax和Cleaved-caspase3的表達(dá)相應(yīng)增加，凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表達(dá)升高最為顯著的是OGD4+R24組。據(jù)此，推斷缺血再灌注誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激性的細(xì)胞凋亡。為了探討α-LA對PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，通過CCK-8細(xì)胞活性試劑盒篩選得到了α-LA發(fā)揮保護(hù)作用的最適有效工作濃度為0.50 mmol/L，并以此濃度在再灌注階段共同作用于PC12并分析了其相關(guān)的凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子(Bax、Cleaved-caspase3、GRP78和CHOP)的表達(dá)量變化。值得欣喜的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α-LA可以有效降低缺血再灌注誘導(dǎo)的相關(guān)凋亡分子的升高，其表現(xiàn)為裂解型的caspase3和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)減少。為了進(jìn)進(jìn)一步探討其發(fā)揮將降凋亡作用的機(jī)制，在同樣的處理模型上，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的分子GRP78和CHOP的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)α-LA可以顯著減少OGD/R組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)。

綜上所述，缺血再灌注誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性的凋亡，α-LA可以減少缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，其可能的機(jī)制是α-LA通過減少缺血再灌注誘導(dǎo)的過度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞免于缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。本研究為缺血再灌注損傷的分子機(jī)制提供了一定的理論證據(jù)，為α-LA的臨床用藥或藥效學(xué)提供了理論指導(dǎo)。