王榮斌， 趙天宇， 卓俊林， 劉春立,2,3， 劉秀霞,2,3， 楊艷坤,2,3， 白仲虎,2,3

(1. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室， 無錫 214122； 2. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122； 3. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122)

MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信號通路是調(diào)控酵母生命過程重要和高度保守的信號傳導途徑之一，包括了4條MAPK信號途徑，分別由α因子信息素、饑餓、高滲、細胞壁壓力4種信號所誘導。其中，高滲透性甘油促分裂原活化蛋白激酶(High osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase，MAPK/HOG)信號通路在酵母適應外界滲透壓變化中起著非常關鍵的作用，該途徑在高滲應激環(huán)境下控制信號轉(zhuǎn)導和基因表達，是細胞生存所必需的[1-2]。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，MAPK/HOG信號通路已經(jīng)研究的比較清楚[3]：外界的高滲信號通過兩個分支的MAPKKK蛋白激酶激活MAPKK蛋白激酶Pbs2，之后MAPK蛋白激酶Hog1被Pbs2磷酸化以激活下游Hot1、Msn2/4和Sko1等轉(zhuǎn)錄因子[4-5]。研究表明，Hot1、Msn2/4和Sko1負責激活88%的Hog1依賴性下游基因，從而促進甘油的轉(zhuǎn)運或甘油的自身合成，以響應外界滲透壓的變化[6]。其中，Hot1被Hog1活化后通過提高甘油合成基因GPD1和GPP2的表達[7-8]，以及提高甘油轉(zhuǎn)運相關蛋白STL1的表達兩個方面提高胞內(nèi)甘油的水平以保持細胞內(nèi)外的滲透壓平衡[9]，維持細胞正常的分裂和生長，是細胞抵抗高滲十分關鍵的轉(zhuǎn)錄因子。

甘油是巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)廣泛應用的碳源[10]，高濃度甘油形成的高滲環(huán)境，影響細胞周期和細胞代謝。而針對畢赤酵母MAPK/HOG信號通路的研究很少，因此不能很好地解決上述問題，這對此系統(tǒng)的應用十分不利。與釀酒酵母相比，畢赤酵母中的Hog1具有85%的同源性，然而Hot1、Msn2/4和Sko1等Hog1的主要轉(zhuǎn)錄因子同源性卻很低。這表明，畢赤酵母MAPK/HOG信號通路可能已經(jīng)發(fā)生了很大的變化，響應高滲的機制也相應改變。

本研究運用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除畢赤酵母MAPK/HOG信號通路中重要轉(zhuǎn)錄因子基因PBS2、HOG1、HOT1和HOT2[11-12]，并檢測了它們下游相關高滲應答基因MSN2、GT1、GPD1、DOG2、DAK1、HXT1、HSP12以及CTT1的轉(zhuǎn)錄水平，提出了巴斯德畢赤酵母MAPK/HOG信號通路模型。

1 材料與方法

1.1 主要材料

畢赤酵母GS115(組氨酸缺陷型)、大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；畢赤酵母GS115-Cas9菌株、sgRNA-BamH I質(zhì)粒由本實驗室構建；所用引物由蘇州金唯智生物科技公司合成；Ultrapure RNA Kit購自北京康為世紀生物科技有限公司；其他本文所用設備、材料參照文獻[13]。

1.2 sgRNA質(zhì)粒的構建

將基因序列輸入至網(wǎng)站(http://www.rgenome.net)中，選擇PAM類型和菌種，選擇評分高、GC含量合適的sgRNA序列，之后進行脫靶效應分析，以獲得特異性高的sgRNA。sgRNA質(zhì)粒構建思路如圖1所示，根據(jù)sgRNA序列設計引物，并利用PCR的方法形成重組片段，將其和BamH I線性化的sgRNA-BamH I質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，利用菌落PCR和測序獲得正確的克隆。

圖1 sgRNA質(zhì)粒構建思路

注：引物中黑色方塊代表同源臂，紅色方塊為sgRNA序列，橙色方塊代表sgRNA前6個堿基的反向互補序列，綠色方塊為核錘頭序列

1.3 畢赤酵母感受態(tài)的制作和轉(zhuǎn)化

畢赤酵母的感受態(tài)制作和轉(zhuǎn)化(電擊法)實驗步驟參照Invitrogen官方手冊。

1.4 敲除菌株的篩選

轉(zhuǎn)化后的酵母在組氨酸篩選平板上30 ℃培養(yǎng)2～3 d，所得單菌落挑至液體培養(yǎng)基中30 ℃，230 r/min過夜培養(yǎng)，之后提取酵母基因組DNA，提取方法參照文獻[13]，利用PCR方法擴增出目的片段后，進行測序驗證。

1.5 高滲處理

固體培養(yǎng)：細胞于YPD培養(yǎng)基中過夜活化后，以OD600=0.3接種至新鮮YPD，至OD600=2.0時取相同菌體量進行10倍梯度稀釋，3 μL接種至YPD和YPD+0.375 mol/L KCl固體平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌體生長情況。

液體培養(yǎng)：酵母過夜活化后，以OD600=0.1接種至新鮮YPD至OD600=1.0，取樣并加入KCl溶液(終濃度0.375 mol/L)，于10和30 min取樣(結(jié)合前期實驗和文獻報道[6]確定)。

1.6 畢赤酵母RNA提取和轉(zhuǎn)錄水平檢測

采用Ultrapure RNA Kit提取酵母總RNA，提取步驟參照試劑盒說明書；反轉(zhuǎn)錄及qPCR方法參照文獻[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA質(zhì)粒的構建

畢赤酵母基因組注釋中，有兩個基因被注釋為HOT1(Gene ID: 8196835，8200862)[14]，將8196835稱為HOT1，8200862稱為HOT2[15]。針對PBS2、HOG1、HOT1和HOT2 4個基因，設計了評分大于70、高特異性的sgRNA，如表1所列。根據(jù)方法1.2進行重組，轉(zhuǎn)化子菌落PCR所得條帶與理論條帶750 bp一致(圖2)，測序結(jié)果表明已獲得正確克隆。

表1 sgRNA 序列

M: DL2000 Marker; 1～19: 待檢測克隆

圖2sgRNA質(zhì)粒構建結(jié)果

Figure 2 The results of sgRNA plasmid construction

2.2 敲除菌株的篩選

根據(jù)方法1.4篩選陽性克隆。圖3中紅框區(qū)域發(fā)生了移碼突變或堿基替換，證明已獲得敲除菌株。

2.3 菌株在高滲下的生長

為了驗證Hog1、Hot1和Hot2在細胞抵抗高滲中的作用，檢測了突變菌株在高滲和正常條件下的生長情況。如圖4所示，4種菌株在正常條件下的生長無顯著差異，而hog1Δ、hot1Δ和hot2Δ在高滲平板的生長比對照菌株差，說明在畢赤酵母中Hog1、Hot1和Hot2對抵抗高滲有著重要作用。

圖3 敲除菌株序列比對結(jié)果

圖4 菌株在高滲和正常條件下的生長

2.4 MAPK/HOG信號通路基因的檢測

為了探究P.pastoris的MAPK/HOG信號通路中的基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機制，在高滲和正常條件下，檢測了pbs2Δ、hog1Δ、hot1Δ、hot2Δ和GS115對照菌株中相關基因的轉(zhuǎn)錄[6]。釀酒酵母中Pbs2僅通過蛋白水平磷酸化調(diào)控Hog1，為了確認畢赤酵母中Pbs2對Hog1的調(diào)控，首先檢測了PBS2、HOG1基因的轉(zhuǎn)錄，如圖5-A、B所示，二者在高滲和低滲情況下表達水平基本不變，且HOG1在pbs2Δ的表達與GS115一致，說明Pbs2對HOG1無轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。畢赤酵母中，Pbs2、Hog1具有很高的保守性，并都具有ATP結(jié)合位點和Ser/Thr蛋白激酶催化結(jié)構域，因此推測Pbs2可通過磷酸化調(diào)控Hog1，下文中MSN2、HOT1、CTT1、HSP12等下游基因的轉(zhuǎn)錄在pbs2Δ、hog1Δ中表達情況一致，近一步支持了這個推論。

之后，檢測了Hog1對其下游重要轉(zhuǎn)錄因子MSN2、HOT1和HOT2的調(diào)控。如圖5-C，在高滲和正常條件下，hog1Δ、pbs2Δ菌株中MSN2表達量均下降至GS115的1/3水平，說明Pbs2、Hog1對MSN2轉(zhuǎn)錄起到了重要作用。正常條件下，HOT1在pbs2Δ、hog1Δ菌株中的表達量僅為GS115的1/3(圖5-D)，說明Hog1參與對HOT1轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，但HOT1在高滲條件的表達可恢復至野生型水平，表明HOT1的表達并不完全依賴于Hog1和Pbs2，可能存在其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控HOT1的表達。Pbs2、Hog1在轉(zhuǎn)錄水平不調(diào)控HOT2(圖5-E)。

釀酒酵母中，STL1、GPD1、DOG2、HXT1、DAK1、CTT1及HSP12均為Hog1、Hot1的下游響應基因，為了確認上述基因在畢赤酵母中所受的調(diào)控，對它們進行了轉(zhuǎn)錄水平的檢測。由于STL1和GPD1在釀酒酵母中抵抗高滲的重要作用，先檢測了3種突變株和GS115菌株中GT1(STL1在畢赤酵母中的同源基因[16-17])和GPD1的基因表達情況。釀酒酵母中STL1的表達完全依賴于Hot1和Hog1，二者缺一不可[18]，而畢赤酵母中GT1在敲除菌中依然會響應高滲而高表達，不再依賴于Hog1、Hot1及Hot2的存在(圖5-F)。同時，GPD1不再響應高滲而高表達，在轉(zhuǎn)錄水平也不再受Hog1、Hot1及Hot2的調(diào)控(圖5-G)。

如圖5-H、J，HOG1的缺失影響了DOG2、DAK1和HXT1在正常條件下的表達，但在高滲條件下，它們的表達水平與GS115相當，因此可能存在其他轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控。hot2Δ菌株中HXT1表達量明顯降低，說明Hot2參與對HXT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。CTT1和HSP12對高滲的響應十分顯著，PBS2、HOG1缺失時，CTT1、HSP12表達顯著下降，Pbs2、Hog1對其轉(zhuǎn)錄是必需的(圖5-K和L)。圖5-H、L顯示，Hot1并不參與對這些基因的調(diào)控。

A～L分別為各個基因qPCR結(jié)果，GS115、pbs2Δ、hog1Δ、hot1Δ和hot2Δ表示4種菌株的低滲條件下的轉(zhuǎn)錄水平，菌株后的10和30表示高滲處理時間，如GS115-10表示GS115菌株高滲處理10 min

圖5高滲和正常條件下基因的表達

Figure 5 The expression of relevant genes in pre-stress and hyperosmotic stress condition

2.5 畢赤酵母MAPK/HOG信號通路模型

綜合實驗結(jié)果及前期研究，總結(jié)了P.pastoris的MAPK/HOG信號通路初步模型(圖6)。

外界高滲信號被傳導至Pbs2和Hog1后，Hog1激活Hot1、Hot2和Msn2等轉(zhuǎn)錄因子，使它們激活或抑制下游響應基因DOG2、DAK1、HXT1、HSP12及CTT1的表達，從而對抗外界的高滲環(huán)境。與釀酒酵母相比，調(diào)控機制已發(fā)生改變，主要體現(xiàn)在：1)雖然Hog1是主要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，但可能存在其他可激活下游基因的轉(zhuǎn)錄因子；2)GT1、GPD1等基因在轉(zhuǎn)錄水平不再受Hot1、Hot2的調(diào)控，Hot2只調(diào)控HXT1的轉(zhuǎn)錄；3)與釀酒酵母相比，畢赤酵母通過提高甘油相關基因GT1、GPD1表達抵抗高滲的能力有限；而CTT1和HSP12等負責修復的基因表達量卻提高很多，CTT1與DNA損傷修復和細胞壽命有關[19]，HSP12與細胞膜維持有關[20]。因此，推測畢赤酵母主要是通過維持細胞膜結(jié)構和DNA損傷修復等方面減少高滲對細胞的損傷，具體機制有待進一步研究。

3 結(jié)論

MAPK/HOG信號通路在酵母適應外界滲透壓變化中起著非常關鍵的作用。P.pastoris作為一個主流的外源蛋白真核表達系統(tǒng)，其MAPK信號通路一直未被系統(tǒng)研究。畢赤酵母MAPK/HOG信號通路中Pbs2、Hog1兩個重要的上游轉(zhuǎn)錄因子保守性非常高，但其下游的轉(zhuǎn)錄因子Hot1、Hot2和Msn2與釀酒酵母相比同源性卻很低，因此推測畢赤酵母中MAPK/HOG信號通路可能發(fā)生了改變。本文應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除了關鍵的PBS2、HOG1、HOT1、HOT2等基因，并檢測了高滲和正常條件下相關基因的轉(zhuǎn)錄，確定了畢赤酵母MAPK/HOG信號通路中的相關基因，并提出了畢赤酵母MAPK/HOG信號通路模型，為后續(xù)的研究奠定了基礎。

圖6 巴斯德畢赤酵母MAPK/HOG信號通路模型

注：紅色、綠色和黑色邊框分別代表在高滲下表達升高、降低和不變；箭頭和T形表示上游對其調(diào)控分別是正向和反向，實線表示通過實驗證實，虛線表示推測結(jié)果

在本研究的基礎上，仍有很多研究工作可以開展，例如：存在未知轉(zhuǎn)錄因子參與高滲調(diào)控，但仍需進一步鑒定。此外，本文未涉及蛋白水平調(diào)控機制的研究，蛋白水平調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導方式磷酸化都需要在以后的實驗中進一步研究。