張遠(yuǎn)莉， 龐延軍

(南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210093)

遺傳學(xué)是生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的核心課程，是一門理論與實(shí)踐相結(jié)合的課程，遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)是遺傳學(xué)課程教學(xué)的重要組成部分[1-4]。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)不僅要完成傳統(tǒng)的以驗(yàn)證性和示范性實(shí)驗(yàn)為主的課程，還需要培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲兴季S，提高主觀能動(dòng)性[5-8]。因此我們?cè)谶z傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)中緊密結(jié)合科學(xué)研究，設(shè)計(jì)一些綜合性實(shí)驗(yàn)，將科研成果引入課堂，培養(yǎng)具有創(chuàng)造力的科研人才。

本次綜合性實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)植物抗病基因Pib的片段進(jìn)行人工合成與進(jìn)化，指導(dǎo)學(xué)生從不同的水稻品種中克隆出抗病基因的片段，利用現(xiàn)存的自然變異，采用DNA改組(DNA shuffling)技術(shù)進(jìn)行重組，人工進(jìn)化得到新的基因片段。DNA 改組是目前最常用的人工合成與進(jìn)化基因的技術(shù)之一，它是由Stemmer于1994年首次提出并在美國(guó)Affymax研究所的實(shí)驗(yàn)室取得成功[9-10]，也稱為有性PCR(sexual PCR)、分子育種(Molecular Breeding)。DNA改組主要包括以下幾步：1)模板準(zhǔn)備。單個(gè)基因或一組同源基因?yàn)槟０濉?)酶切：用化學(xué)方法(如脫氧核糖核酸酶I：DNaseI酶切)或物理方法(如超聲破碎法)將基因切割成一系列隨機(jī)大小的小片段。3)無(wú)引物PCR。這些DNA小片段間具有一定同源性，可互為引物，在不加引物的情況下通過(guò)PCR法將小片段組裝成大片段。4)有引物PCR。以無(wú)引物PCR產(chǎn)物為模板，稀釋后，加入合適的引物將大片段相連，得到一個(gè)重組基因文庫(kù)。5)篩選和測(cè)序。將此基因文庫(kù)導(dǎo)入合適質(zhì)粒，篩選、測(cè)序重組子基因。也可將得到的重組子基因，與初始的同源基因混合在一起，作為第二輪DNA改組的模板，重復(fù)上述步驟，直至得到所需的突變基因。DNA 改組技術(shù)是一項(xiàng)全新的體外人工進(jìn)化模式，是迄今為止所建立的最有效的分子進(jìn)化技術(shù)。

通過(guò)本次綜合實(shí)驗(yàn)，可以讓學(xué)生了解分子遺傳學(xué)的基本操作，從分子水平揭示遺傳學(xué)的基本現(xiàn)象與規(guī)律，并通過(guò)綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生初步獨(dú)立進(jìn)行科學(xué)研究的能力和創(chuàng)新能力，為創(chuàng)新型人才培養(yǎng)提供平臺(tái)。

1 實(shí)驗(yàn)方案

1.1 學(xué)生分組與實(shí)驗(yàn)材料

每班學(xué)生約30人，每組4人左右。實(shí)驗(yàn)儀器有微量移液器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、離心機(jī)、搖床、培養(yǎng)箱、滅菌鍋等。實(shí)驗(yàn)試劑：Taq酶、連接酶、PCR相關(guān)試劑購(gòu)自大連寶生物公司；DNaseⅠ 購(gòu)自Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。

實(shí)驗(yàn)材料：提供30～40個(gè)水稻品種。每組同學(xué)合作完成本實(shí)驗(yàn)的所有工作。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案安排

學(xué)生首先以提供的水稻品種為模板，PCR擴(kuò)增得到基因片段(Pib基因)，連入T載體后進(jìn)行測(cè)序，得到親本的基因序列。然后在教師和助教的指導(dǎo)下對(duì)測(cè)序出的序列進(jìn)行分析，挑選合適的基因片段作為下一步人工進(jìn)化的親本。

將各自選取的親本DNA，各取約2 μg混勻，加入DNaseⅠ 15 ℃消化30 min。消化反應(yīng)結(jié)束后，首先80 ℃變性5 min，滅活DNaseⅠ。然后用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下割取50～100 bp的片段，進(jìn)行DNA片段的回收。

在PCR反應(yīng)體系中加入DNaseⅠ消化產(chǎn)物，在不加入引物的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，讓斷裂的片段之間互為引物和模板，進(jìn)行配對(duì)和延伸。

無(wú)引物PCR反應(yīng)結(jié)束以后，需要特異性的擴(kuò)增出重組的目的片段，將無(wú)引物PCR產(chǎn)物純化后，稀釋1000倍作為模板進(jìn)行有引物PCR反應(yīng)(引物序列與產(chǎn)物長(zhǎng)度如表1所示)。有引物PCR反應(yīng)結(jié)束后將得到與親本DNA條帶一樣大小的目的條帶。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，與T載體連接，提取質(zhì)粒，進(jìn)行序列的測(cè)定和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

表1 實(shí)驗(yàn)中引物序列與產(chǎn)物長(zhǎng)度

2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1 實(shí)驗(yàn)親本選擇

要合成某種基因，首先要了解該基因的遺傳資源變異狀況。因此，對(duì)用于合成目標(biāo)基因的材料首先進(jìn)行品種間的遺傳多態(tài)性分析(MEGA軟件：Molecular evolutionary genetics analysis)。給學(xué)生提供30～40個(gè)材料，讓學(xué)生分別對(duì)這些基因進(jìn)行克隆和測(cè)序；匯總后通過(guò)對(duì)序列的分析，挑選合適的基因作為下一步人工進(jìn)化的親本。指導(dǎo)學(xué)生根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)選擇人工進(jìn)化的親本，選擇的親本數(shù)量和品種都由自己決定，學(xué)習(xí)自主選擇和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。表2是其中一組學(xué)生選擇的用于基因重組的7個(gè)親本，它們的平均核苷酸差異度(Pi，Nucleotide diversity)是0.096。

表2 7個(gè)親本基因的核苷酸差異度

2.2 酶切與重組基因文庫(kù)合成

DNA 改組是一項(xiàng)操作性很強(qiáng)的技術(shù)，這種技術(shù)受很多因素的影響，包括DNaseⅠ酶切片段大小，親本DNA序列的差異度和有性PCR，這些因素都將影響DNA改組的結(jié)果。其中親本DNA片段的酶切效果影響最大，因?yàn)橛H本DNA酶切的好壞將直接影響改組的效果，酶切后的片段要求均一性比較好，這樣可以避免某一親本片段的過(guò)于密集。片段大小的選擇也十分重要，一般情況下它與改組的基因片段大小有密切的關(guān)系。改組的片段長(zhǎng)度小于1 kb，則適宜選擇100 bp以下的片段，1～2 kb則適合選擇100～200 bp的片段，片段的大小將直接影響重組體的規(guī)模和序列差異的大小。若選擇太小的片段，則重聚比較困難；選擇太大的片段，則重組的效果較差。在實(shí)驗(yàn)中，我們的目的片段是1500 bp左右。綜合以上考慮，學(xué)生們最后選擇了100 bp左右的片段。在具體實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生們體驗(yàn)了自己設(shè)計(jì)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的過(guò)程，有些實(shí)驗(yàn)條件需要自己多次摸索才能獲得比較理想的結(jié)果(圖1)。雖然實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣，但是學(xué)生們的興趣很大，都希望通過(guò)自己的努力獲得實(shí)驗(yàn)的成功。

M：DL2000 Marker

圖1DNA改組步驟

Figure 1 Procedure of DNA shuffling

2.3 重組基因測(cè)序結(jié)果分析

重組后的基因片段純化后，與Promega T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化以后得到了1000多個(gè)重組克隆，挑選部分重組克隆進(jìn)行序列測(cè)定。然后指導(dǎo)學(xué)生利用生物信息學(xué)軟件(MEGA軟件：Molecular evolutionary genetics analysis)對(duì)序列進(jìn)行分析，部分結(jié)果如圖2和圖3所示。測(cè)定的所有序列之中沒(méi)有任何兩個(gè)一樣的序列，說(shuō)明重組后的群體較大，變異十分豐富，也間接地說(shuō)明了DNA改組后親本序列的交換和重組比較頻繁。核苷酸比較分析發(fā)現(xiàn)，變異大多數(shù)來(lái)源于親本DNA之間的重組和交換，而且交換的頻率較大，也有小部分變異來(lái)源于隨機(jī)突變，如圖2中紅色圓圈標(biāo)注部分。重組后的平均核苷酸差異度達(dá)到了9.3%，與親本基因間的核苷酸差異度基本一致。把重組后的序列與7個(gè)親本序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建(鄰接法NJ：Neighbor-Joining)，顯示重組后的序列分布在不同的分枝上(圖3)，但還是可以看出基本是平均分布在親本序列的周圍，說(shuō)明這些序列的變異主要還是來(lái)自于親本序列片段間的交換，隨機(jī)突變的貢獻(xiàn)不是很大。

圖2 重組基因的核苷酸序列比對(duì)

圖3 重組基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree of DNA shuffling genes

3 總結(jié)

在高等教育階段，教學(xué)和科研是相輔相成的。本實(shí)驗(yàn)中，指導(dǎo)學(xué)生利用基因的DNA 改組技術(shù)，進(jìn)行基因的人工進(jìn)化，學(xué)生分組完成測(cè)序得到的200個(gè)重組體與親本DNA序列完全不同，得到了自然界中不存在的序列，觀察和了解基因的人工進(jìn)化。傳統(tǒng)的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中，多以驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)為主，以掌握實(shí)驗(yàn)方法為出發(fā)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的不同之處是一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)，具有一定生物學(xué)意義，通過(guò)實(shí)驗(yàn)引導(dǎo)學(xué)生學(xué)習(xí)“提出問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題”的方法，較好地激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。近兩年的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)評(píng)分比以前都有所提高，實(shí)驗(yàn)后學(xué)生提交的實(shí)驗(yàn)感想也提出了對(duì)此類綜合性實(shí)驗(yàn)比較感興趣。

DNA改組一般是針對(duì)某個(gè)特定的基因，其主要的優(yōu)勢(shì)在于時(shí)間短，見(jiàn)效快。1994年，Stemmer用DNA改組技術(shù)將細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性提高了32 000倍[10]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，學(xué)生在分子水平上了解生物的遺傳和變異機(jī)制，掌握了如PCR、DNA提取、細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化等分子遺傳學(xué)的相關(guān)技術(shù)。這樣一組綜合實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)一個(gè)月左右，學(xué)生不僅掌握了一些分子遺傳學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，而且學(xué)習(xí)了運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，加強(qiáng)了對(duì)理論知識(shí)的理解，提高了運(yùn)用知識(shí)的綜合能力，同時(shí)也為培養(yǎng)學(xué)生的科研思維能力奠定了基礎(chǔ)。

總之，學(xué)生科研思維和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)是現(xiàn)代高等教育的重要方向，我們將不斷調(diào)整實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案，構(gòu)建完善的實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系，培養(yǎng)高素質(zhì)的科研人才。