陳乃東， 朱 賽， 王榮花， 徐文冬， 石敏珠

(1. 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院， 六安 237012; 2. 安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室院， 六安 237012)

游離氨基酸作為中藥炮制或食品加工過(guò)程中參與米拉德反應(yīng)的底物，是影響中藥炮制中組分變化和食品風(fēng)味的關(guān)鍵物質(zhì)[1-2]。霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)，是蘭科石斛屬的草本植物[3-5]，含多糖、多酚、皂苷、生物堿等成分[6-10]，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、明目、預(yù)防治療心血管疾病、延緩衰老等功效[11-12]。由于霍山石斛鮮品難以保存，傳統(tǒng)用藥方式以其加熱炮制成干燥品的莖入藥，開(kāi)展霍山石斛游離氨基酸研究對(duì)于揭示霍山石斛炮制機(jī)制、霍山石斛資源綜合利用具有重要意義。

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)具有儀器簡(jiǎn)單、樣品用量少、應(yīng)用范圍廣、分離效率高、污染小、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已在中藥的指標(biāo)成分含量分析研究中應(yīng)用廣泛[13-17]。在本課題組的前期研究中，采用柱前衍生化HPLC對(duì)霍山石斛總游離氨基酸進(jìn)行分析[18]，本文構(gòu)建一種異硫氰酸苯脂柱前衍生化-HPCE分離和測(cè)定多種游離氨基酸方法，對(duì)霍山石斛中游離氨基酸進(jìn)行定性定量分析，為深入研究霍山石斛在炮制過(guò)程中所發(fā)生的化學(xué)變化、揭示其炮制機(jī)制及其資源開(kāi)發(fā)利用提供候選方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料2018年4月采自皖西學(xué)院植物園，品種經(jīng)皖西學(xué)院陳乃東教授鑒定為霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)，洗凈，取其根，莖，葉，-50 ℃冷凍干燥至恒重，粉碎以備用。

十水合四硼酸鈉，磷酸氫二鉀，氫氧化鈉(純度≥99.7%，均購(gòu)自西隴化工股份有限公司)，鹽酸(含量36%～38%，中國(guó)宿州化學(xué)試劑有限公司)，正己烷(純度≥95%，美國(guó)Tedia有限公司)，三乙胺(純度≥98%，阿拉丁公司)，乙腈(純度≥99.9%，阿拉丁公司)，甲醇(純度≥99.9%，阿拉丁公司)，異硫氰酸苯酯(PITC)(純度≥99.9%，Sigma-Aldrich公司)。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品:D-脯氨酸(Pro)、L-組氨酸(His)、DL-異亮氨酸(Ile)、L-精氨酸(Arg)、DL-苯丙氨酸(Phe)、DL-色氨酸 (Trp)、D-絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、L-蘇氨酸(Thr)、β-丙氨酸(Ala)、D-亮氨酸(Leu)、L-賴氨酸(Lys)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%。

K1060型高效毛細(xì)管電泳儀(凱奧科技發(fā)展有限公司，北京)，熔融石英毛細(xì)管(永年瑞灃光導(dǎo)纖維廠，50 μm，河北)，SZ-97雙重蒸餾水器(上海精密儀器儀表有限公司，上海)，F(xiàn)A1204B電子天平(越平科學(xué)儀器有限公司，上海)，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(超聲儀器有限公司，浙江昆山)，VORTEX-5 渦旋振蕩器( 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)，BenchTop Pro臺(tái)式凍干機(jī)(美國(guó)VirTis)，RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化

精密稱取12種氨基酸對(duì)照品Trp 2.78 mg，Arg 4.90 mg，Ala 2.21 mg，Ile 2.53 mg，Lys 1.61 mg，Leu 2.61 mg，Phe 3.23 mg，His 3.64 mg，Ser 2.53 mg，Gly 1.79 mg，Pro 3.00 mg，Thr 4.21 mg，置于容量瓶(25.0 mL)中，加0.1 mol/L鹽酸定容至容量瓶刻度。精密量取1.0 mL樣液于具塞試管(10.0 mL)中，加入14%三乙胺(溶于乙腈)，1.2%異硫氰酸苯酯(溶于乙腈)各0.5 mL混勻，室溫避光放置30 min，加入2.0 mL正己烷，用渦旋儀振蕩助溶，靜置10 min，5000 r/min離心10 min，取下層溶液，制得衍生化溶液，并逐級(jí)稀釋，配制成不同濃度的衍生化溶液。

1.2.2 分離方法的優(yōu)化

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm、硼砂-磷酸氫二鉀緩沖液，從緩沖液離子濃度、緩沖液pH值、分離電壓和毛細(xì)管有效長(zhǎng)度4個(gè)方面對(duì)HPCE法分離游離氨基酸的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳分離條件。

1.2.3 游離氨基酸定量分析

1)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的測(cè)定

按1.2.2構(gòu)建的分離方法，檢測(cè)1.2.1配制的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，以峰面積為因變量、濃度為應(yīng)變量，獲得各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)供試品中游離氨基酸含量測(cè)定

將霍山石斛根、莖、葉樣品，以60%甲醇為提取劑、60 ℃超聲輔助提取，固液比=1∶40(g/mL)、超聲提取30 min、超聲功率240 W、提取4次,合并濾液，按1.2.1所述方法衍生化、采用1.2.2構(gòu)建的柱前衍生化-HPCE方法與1.2.3中1)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定霍山石斛根、莖、葉中游離氨基酸種類及其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總游離氨基酸毛細(xì)管電色譜分離條件的確定

2.1.1 緩沖液離子濃度

緩沖液的離子濃度很大程度上影響了最終分離的效果，實(shí)驗(yàn)考察了緩沖液濃度對(duì)氨基酸分離的影響(表1)。

表1 緩沖液離子濃度

各組分的分離度和保留時(shí)間隨著緩沖液離子濃度的增加而增加，當(dāng)緩沖液中硼砂的離子濃度為60 mmol/L，磷酸氫二鉀的濃度為20 mmol/L時(shí)，分離時(shí)間相對(duì)較短、各氨基酸的峰形和分離度也相對(duì)較好(圖1)。

A～E分別對(duì)應(yīng)表1中第1組到第5組實(shí)驗(yàn)的毛細(xì)管電泳結(jié)果

圖1緩沖液離子濃度對(duì)氨基酸分離的影響

Figure 1 The results of the mixed amino acids separated by different ion concentrations of the buffer

2.1.2 緩沖液pH值

考察了pH 8、9、10、11和12的硼砂(60 mmol/L)-磷酸氫二鉀(20 mmol/L) 緩沖溶液對(duì)氨基酸分離的影響，發(fā)現(xiàn)隨著緩沖液中pH值的增大，各標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的保留時(shí)間和分離度也隨之增大，當(dāng)pH 為11 時(shí)分離時(shí)間相對(duì)較短，12種氨基酸7個(gè)可基線分離，另5個(gè)接近基線分離(圖2)。

2.1.3 分離電壓

采用pH 11硼砂(60 mmol/L)-磷酸氫二鉀(20 mmol/L)緩沖溶液，考察了分離電壓為3、5、10、15和20 kV時(shí)的分離情況。結(jié)果表明，當(dāng)分離電壓為10 kV 時(shí)12種混合氨基酸可實(shí)現(xiàn)較好的分離(圖3)。

A～E分別為pH 8、9、10、11和12的緩沖液電泳結(jié)果

圖2緩沖液pH值對(duì)氨基酸分離的影響

Figure 2 The results of the mixed amino acids separated by different pH values of buffer

A～E分別表示分離電壓為3、5、10、15和20 kV時(shí)的分離圖譜

圖3分離電壓對(duì)氨基酸分離的影響

Figure 3 The results of the mixed amino acids separated by different separation voltages

2.1.4 毛細(xì)管有效長(zhǎng)度

考察了有效長(zhǎng)度分別為35、45、55、65和75 cm時(shí)的分離效果。結(jié)果表明，隨著毛細(xì)管有效長(zhǎng)度的增加，混合氨基酸各組分的保留時(shí)間相應(yīng)增加。當(dāng)毛細(xì)管有效長(zhǎng)度為55 cm的時(shí)候，在保證較好的分離度情況下，分離時(shí)間較短(圖4)。

2.1.5 分離條件的確定

綜合上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，異硫氰酸苯脂衍生化的12種混合氨基酸最佳分離條件為：pH 11的硼砂(60 mmol/L)-磷酸氫二鉀(20 mmol/L)緩沖溶液，分離電壓10 kV、毛細(xì)管有效長(zhǎng)度55 cm，在此條件下12種游離氨基酸的全部實(shí)現(xiàn)基線分離(圖5，表2)。

A～E分別表示毛細(xì)管有效長(zhǎng)度為35、45、55、65和75 cm時(shí)的圖譜

圖4毛細(xì)管有效長(zhǎng)度對(duì)氨基酸分離的影響

Figure 4 The results of the mixed amino acids separated by different effective length of capillary

表2 12種游離氨基酸分離度

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定及方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及其方法學(xué)考察結(jié)果

精密量取1.2.1配制的12種氨基酸對(duì)照品溶液，用蒸餾水依次稀釋成不同的濃度，在優(yōu)化的電泳條件下依次進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度X(mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析各標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的檢測(cè)限(LOD)、定量限(LOQ)以及線性范圍(表3)。

2.2.2 精密度

取一定量1.2.1所述方法配制的12種氨基酸對(duì)照品溶液，在優(yōu)化的電泳條件下，日內(nèi)、日間分別連續(xù)進(jìn)樣 3 次，記錄各物質(zhì)對(duì)應(yīng)的遷移時(shí)間和峰面積，以此求得對(duì)應(yīng)的精密度，得到日內(nèi)精密度RSD≤3.1%，日間精密度RSD≤4.6%，說(shuō)明構(gòu)建的方法精密度良好。

2.2.3 實(shí)際樣品分析

1)定性分析

按1.2.3中2)所述方法制備的石斛樣品，在優(yōu)化的最佳電泳條件下測(cè)定，測(cè)得霍山石斛根、莖、葉總游離氨基酸提取物HPCE圖譜(圖6)。

1:精氨酸(Arg); 2:賴氨酸(Lys); 3:色氨酸 (Trp); 4:苯丙氨酸(Phe); 5:異亮氨酸(Ile); 6:亮氨酸(Leu); 7:組氨酸(His); 8:脯氨酸(Pro); 9:蘇氨酸(Thr); 10:絲氨酸(Ser); 11:丙氨酸(Ala); 12:甘氨酸(Gly)

圖5最優(yōu)分離條件下HPCE圖譜

Figure 5 The HPCE map of the 12 amino acids analyzed in the optimal separating conditions

通過(guò)與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比保留時(shí)間及內(nèi)標(biāo)，共從霍山石斛根莖葉總游離氨基酸中鑒定出12種游離氨基酸(表5)。

A～C分別表示霍山石斛莖、葉、根總游離氨基酸HPCE圖譜

圖6霍山石斛莖、葉、根總游離氨基高效毛細(xì)管電泳色譜圖

Figure 6 The HPCE chromatography of the total free amino acids from the stem, leaf and root ofD.huoshanense

表3 12種氨基酸的回歸方程及其相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限與定量限

2)定量分析

按1.2.3中2)制備的石斛樣品，在優(yōu)化的最佳電泳條件下測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各氨基酸在霍山石斛樣品中的含量(表4)。所測(cè)霍山石斛樣品中，葉中的總游離氨基酸含量最高，根中最低。霍山石斛根中精氨酸含量最高，莖中甘氨酸含量最高，葉中異亮氨酸含量最高。

表4 霍山石斛根、莖、葉游離氨基酸含量測(cè)定結(jié)果

2.3 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，按表4所示含量，精密稱定，加入0.5 g的霍山石斛樣品中，根據(jù)1.2.3中2)方法所述，制備加樣回收所需供試品溶液，并按照最佳毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明(表5)，各氨基酸加樣回收率在90.17%～110.25%之間，RSD≤5%(n=3)。

表5 加樣回收率(n=3)

3 結(jié)論

研究了異硫氰酸苯脂衍生化-毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定霍山石斛中12 種游離氨基酸的方法。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，確定霍山石斛游離氨基酸異硫氰酸苯脂衍生化-毛細(xì)管電泳分離條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，毛細(xì)管有效長(zhǎng)度55 cm，pH 11的硼砂 (60 mmol/L) -磷酸氫二鉀 (20 mmol/L) 緩沖溶液，分離電壓10 kV。在該條件下，12種游離氨基酸可在60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，各氨基酸線性相關(guān)系數(shù)R2的數(shù)值均大于0.99，日內(nèi)精密度RSD≤3.1%，日間精密度RSD≤4.6%，加樣回收率在91.2% ～110.25%，RSD均小于5%(n=3)。該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低，重現(xiàn)性較好，可用于霍山石斛中游離氨基酸的分析檢測(cè)。