馬浩天， 張 飛， 張宏江， 史飛飛， 崔紅利， 李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所， 太谷 030801)

水生生態(tài)系統(tǒng)由自養(yǎng)生物、異養(yǎng)生物和分解生物組成。各種生物群落及其與水環(huán)境的相互作用，維持著特定的物質(zhì)和能量循環(huán)，從而構(gòu)成了一個(gè)完整、平衡的生態(tài)單元。但是該系統(tǒng)也會由于某個(gè)種群的過度擴(kuò)大而紊亂，例如藻類[1]。作為主要生產(chǎn)者，藻類廣泛分布于各種環(huán)境的水體，生長速度快，經(jīng)常成為水生生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢種，因而可能造成大規(guī)模暴發(fā)而導(dǎo)致水生生態(tài)系統(tǒng)的退化；另一方面，沉水植物是水生單元的重要組成部分，它具有保持水體清澈、增加物種多樣性、為其他生物提供生長區(qū)域、生活媒介和營養(yǎng)等功能[2-3]。藻類和沉水植物在淡水湖中非常常見，因此，它們之間的生態(tài)位重疊更頻繁，關(guān)系更為密切[4]。兩種物種之間既存在附生等協(xié)同作用，也可存在對碳源和營養(yǎng)鹽的競爭作用，在競爭關(guān)系下，沉水植物往往具有獲得優(yōu)勢的能力[5]。有研究證實(shí)一些沉水植物對微藻具有化感抑制作用[6]。沉水植物化感作用限制藻類的過度繁殖，是水生生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的關(guān)鍵，作為淡水生態(tài)穩(wěn)定和恢復(fù)物種的沉水植物將在水生生態(tài)系統(tǒng)的凈化、穩(wěn)定和正?；矫孀龀龈嘭暙I(xiàn)[7]。

通過沉水植物抑制微藻生長已經(jīng)取得了廣泛的關(guān)注，閆志強(qiáng)等[8]研究了5種沉水植物及其種植水、浸提液對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的化感作用，其中共培養(yǎng)條件的抑藻效果最顯著；楊琳[9]等在研究兩種沉水植物的浸提液對斜生柵藻(S.obliquus) 的化感效應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)眼子菜的效果更好。在化感作用的研究中，為研究化感作用的強(qiáng)弱，實(shí)驗(yàn)往往通過共培養(yǎng)、種植水、浸提液等方式進(jìn)行，且大多探究生物量、抑制率等基礎(chǔ)指標(biāo)，對微藻的逆境生理關(guān)注較少。因此，本文以淡水湖泊中常見的沉水植物箬葉藻(Potamogetonmalaianus)、金魚藻(Ceratophyllumdemersum)，以及淡水水體生態(tài)常用指示生物斜生柵藻(S.obliquus)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，擬通過測定微藻相關(guān)逆境指標(biāo)，為上述沉水植物化感作用的效果評價(jià)、機(jī)理解釋、生態(tài)學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料及培養(yǎng)

受試植物斜生柵藻(S.obliquus)、箬葉藻(P.malaianus)、金魚藻(C.demersum)均保管于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。斜生柵藻采用BG11培養(yǎng)基pH 7.2±0.2培養(yǎng)于光強(qiáng)3000 lx、光暗比12 h∶12 h、溫度25 ℃±1 ℃的光照箱中。沉水植物經(jīng)蒸餾水沖洗去除雜質(zhì)、5%次氯酸鈉溶液消毒及漂洗后移入BG11培養(yǎng)基中，進(jìn)行為期14 d的適應(yīng)性培養(yǎng), 培養(yǎng)條件均與斜生柵藻相同。

1.2 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置

根據(jù)前人湖泊生態(tài)學(xué)沉水植物豐度的調(diào)查結(jié)果[10]，將沉水植物的生物量控制在4.0 g/L左右，即取箬葉藻、金魚藻、金魚藻+箬葉藻各3.0 g, 分別接種于含有750 mL 已滅菌BG11培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，并接入斜生柵藻，初始接種量為2.8×105cells/mL，另取750 mL已滅菌 BG11培養(yǎng)基，接入密度為2.8×105cells/mL的斜生柵藻作為空白對照。共設(shè)4個(gè)處理，每個(gè)處理各重復(fù)3次。將三角瓶移至山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)(光強(qiáng)3000 lx, 光暗比12 h∶12 h，pH 7.2±0.2, 溫度25 ℃±1 ℃), 每日隨機(jī)調(diào)換各瓶位置，實(shí)驗(yàn)持續(xù)一周。

表1 BG11培養(yǎng)基的成分

1.3 柵藻生物量測定

柵藻生物量采用血球計(jì)數(shù)板法。每日17:00取100 μL混勻后的水樣，經(jīng)魯格試劑固定后置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 柵藻生理指標(biāo)的測定

1.4.1 柵藻葉綠素?zé)晒庥^察

取藻樣20 μL滴于載玻片上，小心加蓋蓋玻片，防止產(chǎn)生氣泡，隨后將玻片置于正置熒光顯微鏡(OLYMPUS, BX53),選擇藍(lán)光為激發(fā)光，在鏡下觀察并拍照。

1.4.2 柵藻葉綠素含量的測定

葉綠素含量測定參照Arnon等的方法[11]，取藻樣8 mL, 10 000 r/min 離心10 min后將藻細(xì)胞重懸于5 mL 80% (V/V) 預(yù)冷丙酮中，石英砂研磨后將勻漿離心(10 000 r/min, 10 min, 4 ℃),取上清液，使用分光光度計(jì)測定645和663 nm處的吸光值，按照下式計(jì)算：

葉綠素b含量=總?cè)~綠素含量-葉綠素a含量

公式中：A663為663 nm樣品吸光值，A645為645 nm樣品吸光值。

1.4.3 柵藻粗酶液的提取及抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的測定

試驗(yàn)結(jié)束后收集藻類培養(yǎng)物樣品(50 mL)，以4000 r/min離心20 min，棄去上清液。將收集的藻類轉(zhuǎn)移到5 mL PBS緩沖溶液(pH 7.8)中，在4 ℃下用石英砂研磨，將研磨后的勻漿在4 ℃下以8000 r/min離心20 min。上清液用于測定CAT、SOD、POD、MDA等指標(biāo)，CAT采用紫外分光光度法[12]，SOD采用氮藍(lán)四唑法[13]，POD采用愈創(chuàng)木酚法[14]，MDA采用硫代巴比妥酸法[15]測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

沉水植物對斜生柵藻的抑制率公式[16]如下：

公式中：Id為抑制率/(%)，N0為空白對照中的微藻生物量，N為處理組中的微藻生物量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS13.0軟件(SPSS Inc.), Tukey法分析試驗(yàn)結(jié)果在P<0.05水平上是否具有顯著性差異，使用Origin8.0軟件(OriginLab Inc.)繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種沉水植物對斜生柵藻的生長抑制效應(yīng)

兩株沉水植物對斜生柵藻的細(xì)胞密度影響見圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種沉水植物(金魚藻、箬葉藻)及其混合種植對斜生柵藻的生長具有顯著的抑制作用，隨著培養(yǎng)周期的增加，微藻的細(xì)胞密度漸進(jìn)性減少，在第6天時(shí)達(dá)到最低，與金魚藻共培養(yǎng)的柵藻密度為0.44×105cells/mL, 與箬葉藻共培養(yǎng)的柵藻密度為0.42×105cells/mL, 而在沉水植物混合種植的條件下，微藻的生物量為0.66×105cells/mL；均顯著低于空白對照組生物量(9.82×105cells/mL)。

沉水植物對斜生柵藻的抑制率也隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，并在第6天時(shí)達(dá)到最大，金魚藻對藻類的抑制率達(dá)到95.5%，箬葉藻達(dá)到95.7%，混合組達(dá)到93.2%。第7天時(shí)，抑制率有所下降，微藻生物量有一定程度的恢復(fù)，但是仍然保持在極低水平(圖1)。

2.2 兩種沉水植物對斜生柵藻葉綠素含量的影響

采用熒光顯微鏡觀察葉綠素自發(fā)熒光進(jìn)行定性分析。如圖2所示，空白對照組柵藻細(xì)胞在白光下清晰可見，顏色呈現(xiàn)深綠色，在藍(lán)光激發(fā)下，細(xì)胞中的葉綠素自發(fā)橘紅色熒光，熒光清晰、均勻，未見異常光點(diǎn)；在金魚藻處理中，藻細(xì)胞顏色較淺，但尚可觀察，藍(lán)色激發(fā)光下表現(xiàn)出不均一的紅色，摻加黃綠色光點(diǎn)；柵藻細(xì)胞在箬葉藻處理中較為透明，白光下若干細(xì)胞不可見，僅能在激發(fā)光下觀察到亮度較高的綠色，形態(tài)不規(guī)整，樣本以亮綠色居多；與箬葉藻處理相同，混合組內(nèi)若干藻細(xì)胞在白光下不可見，激發(fā)光下表現(xiàn)出亮綠色，紅色光較少。

圖1 共培養(yǎng)條件下沉水植物對斜生柵藻的生長影響及抑制率

通過檢測葉綠素a、b含量進(jìn)行定量分析。如圖3所示，與對照相比，各個(gè)處理均顯著減少了斜生柵藻葉綠素a、b的含量(P<0.05)。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，箬葉藻影響下的柵藻葉綠素含量僅相當(dāng)于空白對照組的30%左右，在其余處理中，柵藻的葉綠素含量也有所下降，但均不如箬葉藻組明顯。

圖2 葉綠素自發(fā)熒光定性檢測

2.3 斜生柵藻應(yīng)對沉水植物化感作用的生理響應(yīng)

斜生柵藻在沉水植物抑制時(shí)會產(chǎn)生生理應(yīng)答，因此本實(shí)驗(yàn)測定了各處理中斜生柵藻抗氧化酶活、丙二醛和可溶性蛋白、可溶性多糖的影響。

2.3.1 沉水植物對斜生柵藻抗氧化系統(tǒng)的影響

過氧化氫酶活性是衡量細(xì)胞清除過氧化氫能力的重要指標(biāo)。在沉水植物組中，CAT顯著增高，與對照相比，最高增加了57.4%(箬葉藻組)。丙二醛通常用來反映細(xì)胞膜脂過氧化程度。3組處理均顯著提高了柵藻細(xì)胞丙二醛的含量(P<0.05)。與空白對照相比，金魚藻組、混合組分別提高了88.3%、89.3%的丙二醛，而箬葉藻組相對增加較少，約為83.3%。

過氧化物酶是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的重要酶，一定程度上反映衰老程度。與先前的指標(biāo)類似，其在沉水植物影響下顯著增高；不同的是，超氧化物歧化酶活性增加不明顯，各個(gè)處理間差異不太顯著。

圖4 沉水植物對斜生柵藻抗氧化系統(tǒng)的影響

2.3.2 沉水植物對斜生柵藻可溶性蛋白、可溶性糖的影響

可溶性蛋白質(zhì)和糖含量如圖5所示。沉水植物抑制了斜生柵藻的蛋白質(zhì)含量(柱狀圖)，各處理均低于對照(P<0.05)，但糖合成受到刺激，可溶性糖含量增多。

圖5 沉水植物對柵藻可溶性蛋白、可溶性多糖含量的影響

3 討論

沉水植物通過分泌化學(xué)物質(zhì)抑制同一環(huán)境內(nèi)微生物藻類的生長，這似乎可以作為控制水體藻類數(shù)量的方法，但是沉水植物的種類、生物量等條件都會影響對藻類的化感作用[17]。本研究通過參考淡水湖泊中沉水植物的最大生物量設(shè)置濃度，選擇了兩種常見的沉水植物(金魚藻、箬葉藻)，以及淡水環(huán)境常用指示藻種(斜生柵藻)作為供試材料，在相對自然的生物量條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探究沉水植物化感作用對斜生柵藻的影響。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金魚藻、箬葉藻及其混合培養(yǎng)，都會對斜生柵藻的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，并持續(xù)較長時(shí)間，這與先前的諸多報(bào)道基本相似；在共生條件下，微藻生長勢的抑制可能是由于營養(yǎng)元素的缺失或者沉水植物遮擋光照而引起的，然而，根據(jù)Wu等[18]的研究，營養(yǎng)鹽競爭、影響光照等因素均可以排除。

另外，在第7天時(shí)，微藻的生物量呈現(xiàn)一定程度的恢復(fù)趨勢，推測生物量的恢復(fù)與沉水植物分泌的化感物質(zhì)的揮發(fā)或者分解有關(guān)[19]，因其多為有機(jī)酸、揮發(fā)油和酚類[20-21]。

在生理學(xué)層面上，藻類可以對化感抑制做出反應(yīng)，其光合系統(tǒng)、抗氧化防御系統(tǒng)和膜脂質(zhì)過氧化都會發(fā)生一系列變化。測定逆境生理學(xué)指標(biāo)有助于明確化感物質(zhì)抑制藻類的機(jī)理，然而，現(xiàn)有的大部分研究大多著重于測定微藻生物量等基礎(chǔ)指標(biāo)，對逆境指標(biāo)測定甚少。

葉綠素是藻類光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[22]。在本研究中，與沉水植物共培養(yǎng)時(shí)藻類葉綠素濃度降低，葉綠素自發(fā)熒光變?nèi)?，可能是因?yàn)榛形镔|(zhì)導(dǎo)致微藻葉綠素的降解，這證明柵藻光合系統(tǒng)的損傷。

抗氧化酶活性通常用來衡量活性氧積累和細(xì)胞的抗氧化能力。通常情況下，ROS在以POD、CAT和SOD等酶組成的抗氧化系統(tǒng)作用下穩(wěn)定代謝[23]。在本研究中，POD、CAT等抗氧化酶含量升高，以緩解化感抑制下的ROS積累；SOD的含量變化不明顯，可能是因?yàn)镾OD的合成結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致SOD的活力下降，因此CAT和POD的含量維持高水平用以對抗活性氧迸發(fā)，植物細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)具有多種抗氧化酶，其中各個(gè)酶的關(guān)系和反應(yīng)先后仍需進(jìn)一步研究。膜脂過氧化程度通常用MDA衡量，本實(shí)驗(yàn)中，SOD的活性下降，抗氧化防御效率降低，自由基紊亂，膜脂過氧化加劇，因而MDA含量增加[24]。

不同處理的可溶性蛋白含量下降，可能是在化感物質(zhì)脅迫下，藻細(xì)胞蛋白質(zhì)合成機(jī)制被破壞，另一方面，隨著抗氧化系統(tǒng)效率變低，過量的ROS阻礙了酶的合成機(jī)制，因此導(dǎo)致了總蛋白的缺失[25]。相反，可溶性總糖含量顯著增加，猜測是藻細(xì)胞為了去除過量的ROS而產(chǎn)生具有抗氧化功能的糖，Li等[26]的研究證明一種念珠藻可以分泌具有抗氧化功能的糖，可以增強(qiáng)抗氧化活性?？傊?，沉水植物可以通過產(chǎn)生特異性的抑制微藻生長、光合作用及抗氧化酶系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)，從而在競爭中取得優(yōu)勢。

4 結(jié)論

現(xiàn)階段微藻雖已在實(shí)際生產(chǎn)中大規(guī)模引用，例如生物質(zhì)生產(chǎn)、污水處理等生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)[27]，但是自然水體中微藻的暴發(fā)往往會導(dǎo)致水生態(tài)系統(tǒng)的崩潰。生物控藻、殺藻等技術(shù)愈來愈重要，與傳統(tǒng)化學(xué)殺藻劑相比也更符合綠色生態(tài)平衡的理念，因此基于化感作用的控藻技術(shù)得到了較多生態(tài)學(xué)工作者的關(guān)注。在本研究中，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)沉水植物在共培條件下均可抑制斜生柵藻的生長，并對其抗氧化系統(tǒng)和光合系統(tǒng)造成較大損害，為后續(xù)化感作用抑制微藻的分子機(jī)理奠定了生理學(xué)基礎(chǔ)。