王鵬飛，劉 嬌，高 速，張 姣，張 晗,2，楊 琳,2，王小平*，白吉慶,2**

(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥原料質量監(jiān)測技術服務中心，陜西 咸陽 712046)

浮小麥為禾本科植物小麥TriticumaestivumL.的干燥輕浮癟瘦的果實[1-2]，始載于《本草綱目》[3]，其性涼，味甘咸，入心、脾、腎經，具有止汗、除熱、益氣、養(yǎng)心安神的功效，對自汗、盜汗、骨蒸勞熱、心神不寧、驚悸等疾病有較好的療效[4-7]?，F行2015年版《中國藥典》四部僅在“成方制劑中本版藥典未收載的藥材飲片”中記載了浮小麥的來源，未對浮小麥藥材質量控制做進一步要求。據報道，其含有5-二十一烷基間苯二酚、亞油酸、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖、棉子糖等多種成分[5,8]。其中文獻報道5-二十一烷基間苯二酚具有止汗，能抑制大鼠足趾部位汗點數等作用[5,9-10]，與浮小麥的功能主治相一致。基于此，采用HPLC對14批浮小麥中5-二十一烷基間苯二酚含量進行了測定，并建立了浮小麥的指紋圖譜，為浮小麥的質量控制和評價奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

戴安Ultimate 3000全自動高效液相色譜儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司，包含Ultimate 3000四元梯度泵、Ultimate 3000自動進樣器、Ultimate 3000二極管陣列檢測器、chromeleon 6.8色譜工作站)；Discovery DV215CD型雙量程電子分析天平(瑞士賽多利斯集團；0.01 mg；0.1 mg)；Direct-Q 3UV純化水機(默克密理博)；超聲清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；DFT-50A手提式高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司制造)。

1.2 試驗藥材與試劑

浮小麥經陜西中醫(yī)藥大學白吉慶副教授鑒定為禾本科植物小麥(TriticumaestivumL.)的干燥輕浮癟瘦的果實，來源信息見表1；5-二十一烷基間苯二酚對照品(江西佰草源生物科技有限公司，BCY-01581，質量分數≥98%)；乙腈、甲醇(美國迪馬公司，色譜級)；水為超純水(自制)；其他試劑均為分析純。

表1 浮小麥樣品來源信息

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝優(yōu)化

以5-二十一烷基間苯二酚含量為評價指標，按L9( 34) 正交試驗表安排試驗，并進行極差和方差分析。考察甲醇濃度(A) 、超聲時間(B) 、提取次數(C)3個因素，每個因素3個水平。因素水平表見表2。

表2 浮小麥5-二十一烷基間苯二酚提取工藝因素水平表

Table 2 Factors and levels of extraction technology of 5-heneicosyresorcinol from aestivum

水平因素ABC甲醇濃度/%超聲時間/min提取次數1501512703023100453

1.3.2 5-二十一烷基間苯二酚含量測定

1.3.2.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(95.7∶4.3)，流速為1 mL·min-1；檢測波長205 nm；柱溫30℃；進樣量20 μL。

1.3.2.2 對照品溶液制備 精密稱取5-二十一烷基間苯二酚對照品適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇制成0.093 mg·mL-1的對照品溶液，備用。

1.3.2.3 供試品溶液制備 取浮小麥粉末0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇6 mL，稱定重量，超聲處理(80 W，45 kHz)30 min，放冷，再次稱定重量后，用甲醇補足減失的重量，搖勻，經0.22 um微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.2.4 線性關系 用甲醇將“2.1.2”項下所制對照品溶液逐級稀釋成質量濃度分別為0.0186、0.02976、0.0372、0.0558、0.0744、0.093 ug·mL-1，按“2.1.1”項下色譜條件依次進樣1 μL測定，記錄峰面積，以其質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，線性回歸。

1.3.2.5 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“1.3.2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄5-二十一烷基間苯二酚的峰面積。

1.3.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h，按“1.3.2.1”項下的色譜條件進樣，記錄5-二十一烷基間苯二酚的峰面積。

1.3.2.7 重復性試驗 取S1浮小麥樣品，平行6份，按“1.3.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄5-二十一烷基間苯二酚的峰面積。

1.3.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的浮小麥樣品粉末(S1)6份，每份0.05 g，分別精密加入一定量的5-二十一烷基間苯二酚對照品，按“1.3.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.2.1”項下色譜條件進行測定，計算平均回收率。

1.3.2.9 樣品含量測定 取14批浮小麥樣品各0.1 g，按照“1.3.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.2.1”項下色譜條件進行含量測定，供試品和對照品色譜圖見圖1。

1.3.3 指紋圖譜

1.3.3.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(0～60 min，70% B；60～80 min，0%B)；流速為1mL·min-1；檢測波長205 nm；柱溫40℃；進樣量20 μL。

1.3.3.2 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“1.3.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以3號峰為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，對色譜圖進行相似度分析。

1.3.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h，按“1.3.3.1”項下色譜條件進樣，以3號峰為參照峰，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，將色譜圖進行相似度分析。

1.3.3.4 重復性試驗 取S1浮小麥樣品，平行6份，按“1.3.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.3.1”項下色譜條件進樣分析，以3號峰為參照峰，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，將色譜圖進行相似度分析。

1.3.3.5 浮小麥指紋圖譜的建立 取14批浮小麥藥材樣品，按“1.3.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.3.1”項下色譜條件測定，記錄14批浮小麥樣品的色譜圖。導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A)軟件進行分析，以樣品S1的指紋圖譜為參照圖譜，采用平均數法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.1 s，經多點校正、自動匹配后生成浮小麥藥材指紋圖譜的共有模式，見圖2。

圖1 浮小麥(A)及5-二十一烷基間苯二酚對照品(B) HPLC色譜圖Fig.1 HPLC of aestivum (A) and 5-heneicosyresorcinol Reference (B)

圖2 14批浮小麥HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of 14 batches ofaestivum

2 結果

2.1 5-二十一烷基間苯二酚提取工藝優(yōu)化

由表3可知，甲醇濃度對5-二十一烷基間苯二酚的提取有統(tǒng)計學意義，其中甲醇提取5-二十一烷基間苯二酚含量最高；提取時間和提取次數沒有統(tǒng)計學意義，但是提取30 min比提取15 min的含量高，提取次數對含量影響不大。綜合考慮，即要5-二十一烷基間苯二酚提取含量最高，又要節(jié)約成本，所以確定較佳提取工藝為A3B2C1，即用甲醇超聲30 min提取1次。

表3 優(yōu)化5-二十一烷基間苯二酚提取工藝的正交試驗結果

表4 5-二十一烷基間苯二酚含量方差分析結果

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用二極管陣列檢測器對指紋圖譜和含量測定的檢測波長進行選擇。結果表明，檢測波長在205 nm處所得各色譜峰譜圖信息量較大，且色譜峰分離度較好，故選用205 nm為檢測波長。采用不同的洗脫系統(tǒng)對流動相的組成進行優(yōu)化，5-二十一烷基間苯二酚含量測定最終選用“1.3.2.1”項下的色譜條件進行等度洗脫。指紋圖譜最終選用“1.3.3.1”項下的色譜條件進行梯度洗脫，各色譜分離度好。

2.3 5-二十一烷基間苯二酚含量測定

所得回歸方程為：y=39.215x-0.0155，r =0.9996， 5-二十一烷基間苯二酚質量在0.0186～0.093 ug·mL-1范圍內呈現良好的線性關系；精密度試驗中5-二十一烷基間苯二酚峰面積的RSD值為1.30%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗中5-二十一烷基間苯二酚峰面積的RSD值為1.60%，表明24 h內供試品的穩(wěn)定性良好；重復性試驗中5-二十一烷基間苯二酚含量的RSD值為1.24%，表明該方法的重復性良好；計算平均回收率為101.16%，RSD為0.7%，表明該方法的回收率良好。 14批浮小麥中5-二十一烷基間苯二酚含量分別為3.74、4.51、4.29、 5.02、2.96、2.90、3.38、1.62、3.30、2.35、2.77、2.73、3.17、3.33 mg·g-1。

2.4 指紋圖譜

2.4.1 方法學考察

精密度試驗中，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.12%～0.50%，0.17%～2.91%，相似度均大于0.990，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.08%～1.93%，0.45%～2.99%，相似度均大于0.990，表明24 h內供試品的穩(wěn)定性良好；重復性試驗中，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.06%～1.04%，0.67%～2.98%，相似度均大于0.990，表明該方法的重復性良好。

2.4.2 共有峰標定

根據14批浮小麥藥材指紋圖譜，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A)軟件，共確定出18個共有色譜峰，見圖3。經對照品比對指認了Rt = 60.780 min為5-二十一烷基間苯二酚的色譜峰。在樣品圖譜中選擇峰面積較大3號色譜峰作為參照峰，以參照峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表5、6。

2.4.3 相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系統(tǒng)》(2004 A)對14批浮小麥的指紋圖譜數據進行分析，與共有模式相比較，S11相似度為0.988，其余樣品相似度均達到0.99以上，表明藥材質量穩(wěn)定，差異較小，結果見表7。

2.4.4 系統(tǒng)聚類分析

對14批浮小麥樣品的HPLC指紋圖譜中18個共有峰的峰面積數據導入SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件，采用組間聯接法，以歐式平方距離對樣品進行聚類分析。當臨界值為20時，14個來自不同產地的浮小麥樣品可聚為兩類：第1類為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S12、S13、S14；第2類為S11，結果見圖4。

圖3 12-5-二十一烷基間苯二酚浮小麥藥材HPLC指紋圖譜共有模式(A)和5-二十一烷基間苯二酚對照品色譜圖(B)Fig.3 HPLC fingerprints common model (A) and reference chromatography of 5-heneicosyresorcinol (B)

共有峰相對保留時間S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14RSD/%10.7890.7970.7900.7900.7890.7900.7900.7900.7890.7900.7900.7890.7880.7890.2720.9600.9590.9600.9590.9600.9600.9600.9580.9590.9600.9590.9590.9580.9600.013(S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0041.4121.4101.4111.4111.4111.4101.4551.4521.4121.4001.4101.4111.4101.4100.8851.7671.7661.7691.7681.7681.7671.7681.7681.7681.7621.7651.7671.7671.7670.1061.8941.8921.8941.8931.8921.8921.8941.8941.8931.8791.8911.8931.8931.8920.2171.9411.9381.9401.9441.9401.9381.9401.9391.9391.9331.9381.9391.9391.9380.1282.402.372.392.392.402.412.402.402.392.392.392.412.402.390.1292.5262.5222.5252.5232.5232.5242.5242.5232.5232.5122.5212.5242.5222.5220.13102.5412.5372.5402.5382.5382.5392.5392.5402.5392.5122.5362.5402.5392.5340.28112.6432.6392.6422.6402.6402.6412.6412.6412.6402.6282.6342.6412.6392.6380.14122.6692.6652.6682.6662.6662.6672.6682.6672.6672.6542.6642.6682.6652.6650.14132.7432.7382.7422.7392.7392.7412.7412.7412.7402.7272.7372.7412.7392.7380.14142.7932.7882.7922.7902.7902.7902.7892.7922.7892.7772.7872.7912.7892.7880.14152.8522.8472.8512.8522.8492.8492.8502.8502.8492.8352.8462.8502.8452.8470.17162.8742.8692.8732.8702.8712.8712.8722.8722.8722.8572.8672.8722.8702.8690.14172.9452.9452.9442.9412.9422.9422.9432.9442.9432.9292.9402.9432.9412.9400.14182.9802.9802.9782.9752.9762.9762.9782.9772.9632.9763.0622.9772.9742.9750.78

表6 14批樣品共有峰的相對峰面積

續(xù)表6 14批樣品共有峰的相對峰面積

表7 14批浮小麥相似度分析結果

圖4 14批浮小麥系統(tǒng)聚類分析結果Fig.4 Dendrogram of hierarchical clustering analysis of 14batches of aestivum

3 討論與結論

5-二十一烷基間苯二酚是浮小麥中主要活性成分之一，具有止汗、能抑制大鼠足趾部位汗點數、抑制α-葡萄糖苷酶活性，控制餐后高血糖等作用[9,13]，測定其含量對浮小麥的質量控制具有重大意義。目前，對于浮小麥的質量控制研究主要集中在葡萄糖、棉子糖、亞油酸等化學成分的含量測定[5,11]、生藥學[4,12]等方面，未見對浮小麥藥材的指紋圖譜研究。本研究采用HPLC法測定了14批浮小麥中5-二十一烷基間苯二酚含量在1.62～5.02 mg·g-1之間，平均加樣回收率為101.16%，RSD為0.7%；建立了不同產地浮小麥的HPLC指紋圖譜，標定了18個共有峰，指認了5-二十一烷基間苯二酚1個共有峰。方法學結果表明其精密度、重復性、穩(wěn)定性良好。

從聚類分析結果可知，廣西玉林藥材市場浮小麥(S11)與陜西大多數產地浮小麥差異較大，說明不同省之間浮小麥的質量存在差異，而陜西各批浮小麥相似度均在0.99以上，說明差異較小，質量比較穩(wěn)定。經系統(tǒng)聚類分析，其結果與指紋圖譜的相似度分析結果項一致。

綜上分析，本文建立的浮小麥指紋圖譜及含量測定方法對其質量控制和評價研究具有重要意義，可為浮小麥藥材質量標準的制定提供實驗依據。