魏曉梅，楊文敏，聶賢鋒，吳麗芳

(曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南高原生物資源保護與利用研究中心，云南 曲靖 655011)

金銀花(LonicerajaponicaThunb.)屬忍冬科，多年生半常綠纏繞及匍匐灌木，唇形花有淡香，初夏開花，開放前采收干燥，屬國家名貴藥材之一。我國金銀花主要產(chǎn)于山東平邑、蒼山、費縣和河南新密、鞏義、登封等地[1]。金銀花多糖具有抗凝血[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒、抗輻射、降血壓、降血糖、降血脂[5]等多種作用，是一類重要的生物活性物質(zhì)[6]。劉蓓等發(fā)現(xiàn)金銀花多糖濃度10～250 ug/ml時可顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖[7]。

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. chen ex C. H.)屬五加科多年生草本植物，根狀莖呈圓柱形，塊根及花都有很高的藥用價值[8]，三七的研究重點主要在三七總皂苷領域[9]。此外，三七多糖也是三七中重要的活性成分[10]，在免疫調(diào)節(jié)上具有很大優(yōu)勢[11]，且具有較強的清理ABTS和DPPH自由基的能力，抗氧化活性較高[12]。因此，三七及金銀花多糖因其藥用價值被作為研究熱點，如劉杰[13]對土三七的多糖提取方法及成分進行了詳細探索。殷紅梅等[14]對金銀花多糖提取過程中脫蛋白的工藝進行了優(yōu)化。趙鵬等[15]用響應面法優(yōu)化多糖的修飾及加工，但未見三七及金銀花的多糖對比研究。本研究采用正交試驗分別研究金銀花和三七塊根中多糖的提取，探討并對比其最佳提取工藝，進而比較兩者粗多糖的含量差異，為其進一步開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

三七采自云南省文山州丘北縣二年三七，金銀花采自河南省鞏義市浮戲山山區(qū)。

1.2試劑和儀器設備

離心機(80-1)，數(shù)顯鼓風干燥箱(G2X-9070 MBE)，電子天平(AL240-1C)、恒溫光照培養(yǎng)箱(SPX-250B-G型)、754紫外分光光度計(上海菁華)，電熱恒溫水浴鍋(DK-S26)等。

乙醇(天津市風船化學試劑科技有限公司)，氯仿(天津化學試劑三廠)，丙酮(天津市化學試劑三廠)，正丁醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)等，以上皆為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

采用多因素多水平正交設計(表1、2)，選取云南文山的三七根與河南鞏義的金銀花為原材料，提取樣品中多糖，探討其多糖提取的最佳工藝，并對比兩種樣品中多糖含量的差異，為進一步開發(fā)利用提供理論支持。

表1 L934法提取金銀花多糖試驗設計

表2 L934提取三七多糖試驗設計

1.3.2 試驗方法

金銀花與三七根分別洗凈，粉碎，80℃烘干至恒重，按照試驗設計進行高溫浸提，然后過濾并保存浸提液，過濾后濾渣再次浸提，合并提取液3500 r/min離心15 min，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2，按照設計的醇沉濃度4℃低溫醇沉24 h，3500 r/min離心15 min，Sevag法除去蛋白質(zhì)，至多糖溶液在250～280 nm處無紫外吸收峰為止。氯仿抽提，80%乙醇醇沉，丙酮洗滌，60～70℃烘箱干燥4 h，恒重后稱量所得多糖。記錄并分析。

為研究浸提溫度對金銀花多糖提取的影響，本研究在其它條件相同的基礎上設置了溫度梯度40，50，60，70，80，90，100℃條件下探討多糖提取的差異。金銀花洗凈烘干，粉碎，稱取2 g加入20倍蒸餾水分別置于不同的溫度條件下浸泡3 h，過濾并保存提取液。濾渣中加入20倍蒸餾水重復上述過程，共提取2次，合并提取液3500 r/min離心15 min，取上清液，氯仿萃取2次，70%乙醇醇沉。

根據(jù)此試驗結果選擇三個溫度水平納入正交試驗的一個因素，另選擇三個因素設計金銀花多糖提取正交試驗(見表1)。

三七根洗凈，烘干，粉碎，分為9組每組稱量2 g三七粉，無水乙醇浸泡除去色素，再次離心干燥，按照表2中的四因素三水平進行試驗，90℃水浴浸提，離心取上清液，濃縮后分別加入相應體積乙醇進行醇沉，靜置過夜，洗滌，離心棄上清，干燥后稱重。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對金銀花多糖提取的影響

在其它試驗條件完全相同，但采用不同浸提溫度提取金銀花多糖試驗中發(fā)現(xiàn)，溫度不同金銀花浸提液的色澤差別較大，浸提溫度越高，浸提液顏色越深，說明金銀花中含有一定的色素，這些色素會隨著溫度的升高越容易被提取出來。此外，在醇沉時，觀察發(fā)現(xiàn)60℃醇沉時多糖質(zhì)地均勻細膩，但得量較低，每克金銀花提取多糖0.0245 g(見表3)，80℃條件下多糖得量有所提高，100℃時多糖得量最大，每克金銀花提取多糖0.0391 g，但多糖質(zhì)地較粗糙。但總體呈現(xiàn)浸提溫度越高，多糖提取量越大的趨勢。據(jù)此，在金銀花多糖提取的正交試驗中，浸提溫度分別選擇三個有代表性的60℃，80℃，100℃。

表3 不同溫度條件下金銀花多糖提取率

2.2 正交試驗提取金銀花多糖結果分析

試驗9(A3B3C2D1)提取得到金銀花粗多糖量較多(見表4)，每克金銀花可提取粗多糖0.0305 g，試驗4(A2B1C2D3)提取得到金銀花粗多糖量最少，每克金銀花提取粗多糖量僅0.0180 g，且不同的試驗組合多糖提取量有較大的差異。

表4 L9(34)法正交試驗提取金銀花多糖的結果

計算相應的K值并對比發(fā)現(xiàn)， 與KA2和KA3相比，KA1最大，說明浸提時間3 h為最佳方案，浸提時間延長反而多糖提取質(zhì)量降低；KB3則明顯高于KB1和KB2，表明溫度越高(100℃)提取效果越好；KC2高于KC1和KC3，但三者差距最小，故氯仿浸提次數(shù)對多糖提取影響程度相對于其它因素來說最小，浸提兩次最佳；KD2高于KD1和KD3，說明醇沉濃度70%最佳。

計算R值并對比發(fā)現(xiàn)，選擇的4個因素對金銀花多糖提取的影響力為B > D > A > C，即浸提溫度對金銀花多糖提取量影響最大，此結果與表2顯示的結果一致，隨著溫度上升，多糖得量也逐漸上升；其次是醇沉時乙醇濃度，乙醇濃度為70%時，金銀花多糖提取量最多；然后是浸提時間，浸提3 h時有較好的提取效果；氯仿萃取次數(shù)影響最小，次數(shù)增加對多糖提取量影響不大。因此，為縮短提取時間可選擇較低的萃取次數(shù)。

由試驗結果可得最佳金銀花多糖提取試驗組合為A1B3C2D2，即100℃熱水浸提3 h，氯仿萃取2次，醇沉濃度70%。

2.3 正交試驗提取三七多糖結果分析

由三七多糖提取結果分析可知，試驗組合3(A1B3C3D3)提取得到的三七粉粗多糖量較多(見表5)，每克三七粉提取粗多糖0.1596 g，試驗組合5和組合8分別為0.0224 g/g和0.0220 g/g；試驗組合4(A2B1C2D3)提取得到的三七粉粗多糖量最少，每克三七粉提取到粗多糖量僅為0.0498 g，且不同的試驗組合粗多糖提取量差異較大。

表5 L9(34)法正交試驗提取三七多糖的結果

計算相應的K值并對比發(fā)現(xiàn)，KA1> KA3> KA2，KA1最大，說明最佳料液比是1:20；KB3> KB2> KB1，表明浸提次數(shù)的增加能顯著增加三七粗多糖提取量；KC3> KC1> KC2，說明浸提時間3h有較好的提取效果；KD3> KD1> KD2，說明醇沉濃度80%最佳。

計算R值并對比發(fā)現(xiàn)，選擇的4個因素對三七多糖提取的影響力為D > C > B > A，即醇沉濃度對三七多糖提取量影響最大；其次是浸提時間及浸提次數(shù)；最后是料液比。

因此，三七多糖最佳提取試驗組合為A1B3C3D3，即料液比1:20條件下90℃浸提3次，每次浸提3 h，醇沉濃度80%可得到最多的多糖提取量。

2.4 三七與金銀花多糖提取量比較

分析金銀花與三七正交試驗的9個試驗組合，我們發(fā)現(xiàn)金銀花多糖提取的試驗組合9(A3B3C2D1)中每克金銀花可提取粗多糖0.0305 g，三七多糖提取試驗4(A2B1C2D3)中每克三七提取粗多糖0.1596 g，表明云南文山三七粗多糖的提取量明顯高于河南鞏義的金銀花多糖提取量；金銀花提取試驗4(A2B1C2D3)提取得到的金銀花粗多糖量最少，每克金銀花提取到粗多糖量僅為0.0180 g，而三七多糖提取試驗4(A2B1C2D3)提取得到的三七粉粗多糖量最少，每克三七粉提取到粗多糖量為0.0498 g，即云南文山的三七粗多糖的提取量依舊明顯高于河南鞏義的金銀花多糖提取量。因此，云南文山的三七粗多糖含量應高于河南鞏義的金銀花粗多糖含量。

3 結論

對于植物多糖的研究，國內(nèi)外對三七多糖的研究相比較其它藥用植物來說相對較少[11]，更鮮少研究不同藥用植物之間多糖提取及其對比分析。藥用植物多糖的研究必將進一步指導多糖在臨床方面的應用，為人類造福。金銀花多糖提取試驗中影響因素較大的是浸提溫度，其次是醇沉時乙醇的濃度，然后是浸提時間，氯仿萃取次數(shù)影響最小。金銀花多糖提取的最佳試驗方案為A1B3C2D2，即100℃熱水浸提3 h，氯仿萃取2次，醇沉濃度70%，可得到較多的粗多糖提取量。提取三七多糖時影響較大的因素是醇沉濃度，其次是浸提時間及浸提次數(shù)，最后是料液比。三七多糖提取的最佳方案為A1B3C3D3，即料液比1∶20條件下90℃浸提3次，每次浸提3 h，醇沉濃度80%可得到最多的多糖提取量。云南文山三七根中多糖含量高于河南鞏義金銀花中多糖含量。