郭雙磊張悠然董軍成苑兵艦李凱歌劉紅林*

1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 神經(jīng)外科，河南 開封 475000; 2.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000

阿爾茨海默病(alzheimer's disease， AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，目前尚無法治愈，因此人們對(duì)研究治療阿爾茨海默病的現(xiàn)代藥物有了新的興趣。神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在療法具有挑戰(zhàn)性和創(chuàng)新性，這必然要涉及用于開發(fā)、篩選藥物的優(yōu)化動(dòng)物模型。斑馬魚在藥物遺傳學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)方面正迅速成為一種廣泛使用的有機(jī)體?；驒z測證明，斑馬魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)適用于模擬人類神經(jīng)系統(tǒng)[1]。我們利用該魚自身的appb啟動(dòng)子調(diào)控人APP瑞典型突變基因來構(gòu)建AD 模型，并通過行為學(xué)和病理學(xué)來評(píng)價(jià)模型是否能出現(xiàn)AD 樣病變。希望能為AD 疾病機(jī)制研究提供一個(gè)新的動(dòng)物模型，為研究Aβ蛋白沉積與腦微血管病變神經(jīng)元病變之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年斑馬魚購于武漢國家斑馬魚資源中心，由本實(shí)驗(yàn)室繁殖飼養(yǎng)。養(yǎng)殖水溫度25.0～28.5 ℃，電導(dǎo)保持在450～550 μS/cm 之間，pH 6.5～7.6，硬度6～8。保持光照、黑暗(1.4∶1)交替循環(huán)。豐年蝦凍干粉作為幼魚飼料，豐年蝦作為成魚飼料。

1.2 構(gòu)建APP基因突變體APPswe

人APP是由 pBbluescriptⅡ ks-695大腸桿菌克隆質(zhì)粒(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部饋贈(zèng))中提取的cDNA片段，其595-596位點(diǎn)的堿基G 突變?yōu)門，A 突變?yōu)镃。突變引物是根據(jù)點(diǎn)突變試劑盒設(shè)計(jì)，引物合成由金唯智生物科技公司完成，序列如下(5′-3′)。

上游引物:GCGCCACCTGTCCAATCTGCAG CAGAACGGCT;

下游引物:AGCCGTTCTGCTGCAGATTGG ACAGGTGGCGC;

PCR 反應(yīng)條件:90 ℃預(yù)變性20 s;90 ℃變性40 s;60 ℃退火60 s;70 ℃延伸10 min。20個(gè)循環(huán)。

PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，溶液于-4 ℃冰浴 3 min，然后置于室溫加入1 μL Murazyme 酶，37 ℃溫育2 h。反應(yīng)完畢后加入2 μL SalⅠ切開大腸桿菌克隆質(zhì)粒DNA，約5 min后將其加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)溶液，并加入1 μL Klenow 酶進(jìn)行DNA 鏈接，置冰浴30 min 后，45 ℃熱休克60 s，再放入-4 ℃冷浴2 min，加入無抗性的Luria- Bertani培養(yǎng)液(自 配)400 μL， 37 ℃， 300 r/min 振 蕩 培 養(yǎng)1.5 h。在2個(gè)氨芐青霉素抗性的Luria-Bertani固體培養(yǎng)基平板上各均勻涂布150 μL 菌液，37 ℃培養(yǎng)12～24 h。

待培養(yǎng)基有白色菌落長出，送Invitrogen公司基因測序。得到的菌液再送測序。測序正確的APPswe序列利用 PCR 擴(kuò)增，設(shè)計(jì) PCR 引物，并帶有Sal Ⅰ和 Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn)。

上游引物:CCAAGCTTGCCACCATGCTGCCCGGTTTGG;

下游引物:GCGTCGACCTAGTTCTGCATC TGCTCAAAG;

PCR 反應(yīng)條件:90 ℃預(yù)變性20 s;90 ℃變性40 s;60 ℃退火 1 min;70 ℃延展5 min。40 個(gè)循環(huán)。PCR 結(jié)束后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物。凝膠電泳成像儀觀察 DNA條帶正確性后(2 200 dp)，將目的條帶放入微型離心管中12 000 r/min， 2 min后用回收試劑盒回收得到 PCR 片段產(chǎn)物，留存于-20 ℃?zhèn)溆?。見圖1。

圖1 APPswe產(chǎn)物電泳圖

1.3 構(gòu)建慢病毒載體pTetlIP-APPswe-EGFP

慢病毒載體pTetlIP是在Clontech公司生產(chǎn)的pLVX-TetOne-Puro質(zhì)?；A(chǔ)上改構(gòu)的，具有氨芐青霉素抗性，見圖2。為了讓轉(zhuǎn)座子更有效，我們把質(zhì)粒上的WPRE基因替換成斑馬魚自身appb調(diào)控序列。斑馬魚appb啟動(dòng)子調(diào)控人APP基因片段由北京奧科公司生產(chǎn)。

用 Bam HI和Sal I分別處理慢病毒pTetlIP載體和 PCR 的pEGFP-N1片段后，酶切，回收，連接，轉(zhuǎn)化后得到單菌落，挑選單菌落將質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR 鑒別后，將陽性菌落送至Invitrogen 基因測序，測序確認(rèn)后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。用EcoR I和Sam I雙酶切分別構(gòu)建好 pTetlIP-EGFP 載體和斑馬魚appb基因片段后，酶切，回收，連接，轉(zhuǎn)化后得到pTetlIP-appb-EGFP 單菌落，挑取單菌落將質(zhì)粒經(jīng)菌落 PCR 鑒定后，把陽性菌落送至Invitrogen公司測序，測序正確后進(jìn)行下一步構(gòu)建。用AgeI和Hind III雙酶切構(gòu)建好的 pTetlIP-appb-EGFP載體和 APPswe片段后，酶切，回收，連接，轉(zhuǎn)化后得到pTetlIP-appb-APPswe-EGFP 單菌落，挑取單菌落將質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR 鑒定后，將陽性菌落送至Invitrogen基因測序。部分實(shí)驗(yàn)步驟如下。

用 Sam I和 EcoR I分別處理斑馬魚appb啟動(dòng)子片段和pTetlIP-EGFP 載體，加入酶切體系后，37 ℃孵育4 h后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠分離DNA，在凝膠成像儀中觀察，從凝膠上切下分子量正確的DNA 片段，切下目的條帶放入EP管中，利用瓊脂糖回收試劑盒回收得到 PCR 片段產(chǎn)物pTetlIP-appb-EGFP，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

用Age I和Hind III雙酶切構(gòu)建好pTetlIP-appb-EGFP載體和 APPswe 片段后，每次10 μL連接反應(yīng)體系如下:APPswe片段 4 μL;pTetlIP-appb-EGFP載體 4μL;10×T4 連接反應(yīng)液 1μL;T4-DNA 連接酶 1μL?；靹蚝?，18 ℃反應(yīng)過夜。晨起取反應(yīng)產(chǎn)物10 μL，加入到50 μL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，按照以上步驟轉(zhuǎn)化，再涂抹在LB固體培養(yǎng)基平板上，12～24 h后，得到單菌落，在超凈臺(tái)內(nèi)挑選單菌落，接種于5 mL 的抗氨芐青霉素培養(yǎng)基中， 37 ℃培養(yǎng)12 h。菌液保種，送Invitrogen基因測序。將測序正確的菌液重新培養(yǎng)并按以上步驟進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，最后得到含有斑馬魚appb啟動(dòng)子的pTetlIP-appb-APPswe-EGFP 質(zhì)粒，簡稱pTetlIPAPPswe-EGFP載體。

圖 2 pLVX-TetOne-Puro質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

1.4 感染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y

1.4.1 Tn5轉(zhuǎn)座酶mRNA 制備

使用轉(zhuǎn)座元件表達(dá)載體時(shí)，需要轉(zhuǎn)座酶的幫助[2]。將載體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶一同注入人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中幫助載體整合。Tn5轉(zhuǎn)座酶是RNaseH 樣蛋白超家族(RNHL)成員之一，在DNA 轉(zhuǎn)座整合過程中起關(guān)鍵作用[3]。Tn5質(zhì)粒由金唯智公司合成。

根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書，提取Tn5質(zhì)粒中轉(zhuǎn)座酶mRNA。用 Not I 進(jìn)行Tn5質(zhì)粒單酶切，酶切產(chǎn)物回收后，測得片段濃度為 0.45 ng/μL。取4 μL 濃縮回收的片段37 ℃轉(zhuǎn)錄 2 h，轉(zhuǎn)錄完成后，用 RNA 純化試劑盒純化產(chǎn)物。得到 mRNA 通過濃度測定得到濃度為480 ng/μL，將其稀釋，按照50 ng/μL 進(jìn)行分裝，保存于-20 ℃，用于注射。

1.4.2 pTetlIP-APPswe-EGFP注入SH-SY5Y 細(xì)胞并培養(yǎng)

SH-SY5Y 細(xì)胞由上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)。將pTetlIP-APPswe-EGFP(50 ng/μL)和Tn5轉(zhuǎn)座酶mRNA(50 ng/μL)用Eppendorf顯微注射針對(duì)SH-SY5Y 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個(gè)SH-SY5Y 細(xì)胞注射約2 nL 質(zhì)粒混合液，注射后的細(xì)胞移植在復(fù)方DMEM+體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清固體培養(yǎng)基，并用Amp(氨芐青霉素抗性)進(jìn)行抗性克隆的篩選。Amp的劑量從100 μg/mL 開始，每間隔2 d遞增200 μg/mL，升到1 000 μg/mL，維持此濃度直到單克隆形成。對(duì)氨芐青霉素抗性克隆進(jìn)行PCR 傳代擴(kuò)增，提取RNA 及蛋白并進(jìn)行鑒定。

1.5 建立熒光標(biāo)記的APPswe細(xì)胞移植斑馬魚

1.5.1 顯微注射平皿的準(zhǔn)備

用蒸餾水和瓊脂糖配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖溶液，微波爐加熱溶解后，倒入100 mm×20 mm 的平皿中，同時(shí)輕輕放入4×6凹陷狀的模具使其漂浮在溶液表面，30 min后瓊脂糖成固體后檢出模具，將制備好的注射平皿存貯于4 ℃冰箱，備用。

1.5.2 受精卵的準(zhǔn)備

注射前一天晚上，雌、雄斑馬成魚按1∶1配對(duì)，放入交配魚缸內(nèi)，透明板將雌雄魚隔開，次日清晨給光抽板讓其追尾產(chǎn)卵受精，20 min 左右收集受精卵，以保證所得受精卵為單細(xì)胞期。用Eze-Rinka培養(yǎng)液清洗魚卵以除去糞便等雜物。用虹吸管將受精卵規(guī)則排列在制備好的瓊脂糖平皿的凹槽中。

1.5.3 顯微注射

受精卵排出后2.5～4.5 h時(shí)間段進(jìn)行顯微注射，這個(gè)時(shí)間段是斑馬魚囊胚期。用移液器吸取5 μL小心填入已經(jīng)處理好的注射針中。將針插入顯微操作持針儀，調(diào)整注射參數(shù)，通入凈化空氣保證每次注射液量為2 nL 左右。將混合物共同注射到斑馬魚囊胚內(nèi)。

1.5.4 APPswe細(xì)胞移植斑馬魚的培育

采集所有注射完畢的斑馬魚胚囊，置28 ℃生化培養(yǎng)箱和Eze-Rinka養(yǎng)殖液中培育，及時(shí)挑出死亡胚胎，每天定時(shí)更換新鮮養(yǎng)殖液。注射24 h后的胚囊，斑馬魚appb基因開始表達(dá)，在熒光顯微鏡下，仔細(xì)挑選頭部有明顯綠色熒光蛋白表達(dá)的胚胎繼續(xù)養(yǎng)殖至成魚。

1.6 APPswe細(xì)胞移植斑馬魚品系鑒定

選擇6 mon以上成年斑馬魚，根據(jù)Trizol試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA 的采集，繼而用RQI RNase-free DNase清除殘存的DNA。所得到RNA經(jīng)跑膠鑒定后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，根據(jù)APPswe序列設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證。

反應(yīng)條件:45 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min，90 ℃滅活后加反轉(zhuǎn)錄酶3 min。擴(kuò)增循環(huán)為90 ℃，30 s;50 ℃，30 s;70℃，1 min。共進(jìn)行50輪循環(huán)。然后取10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳與1 kb DNA Ladder比較。

1.7 迷宮行為學(xué)檢測

本研究選用T 型行為學(xué)迷宮(圖3)，迷宮分為70 cm 豎直通道和50 cm 等長左右通道，右通道連接EC 區(qū)。隨機(jī)選擇APPswe細(xì)胞移植斑馬魚12條及野生型斑馬魚12條，兩組魚群在月齡、體質(zhì)量、身長等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。斑馬魚行為采用Noldus-Vision系統(tǒng)監(jiān)測并依照測試步驟進(jìn)行[4]。檢測前，將所有待測斑馬魚放在新環(huán)境T 型迷宮中活動(dòng)3 h。檢測逐條進(jìn)行，將斑馬魚置于豎直道起點(diǎn)，測試時(shí)間6 min，記錄魚從始點(diǎn)到進(jìn)入EC區(qū)的時(shí)間間隔(唯有當(dāng)魚在EC區(qū)停留超過30 s，才判定為到達(dá)終點(diǎn))。魚到達(dá)EC 區(qū)后，在EC 區(qū)內(nèi)獎(jiǎng)勵(lì)食物。6 min仍未找到EC區(qū)的魚，實(shí)驗(yàn)者驅(qū)趕其到達(dá)EC區(qū)，在EC區(qū)停留3 min并給予食物。所有進(jìn)入EC區(qū)進(jìn)食3 min之后，震蕩EC 區(qū)液體，觀察斑馬魚逃離EC區(qū)的時(shí)間。每條魚檢測后放入有編號(hào)的單獨(dú)容器中。每天上午9:00開始檢測，連續(xù)檢測4 d，所有魚檢測期間只有在EC區(qū)給予食物。最后計(jì)算平均行為反應(yīng)時(shí)間。

圖3 T 型行為學(xué)迷宮

1.8 透射電鏡觀察腦超微結(jié)構(gòu)

T 型迷宮檢測后，挑選有行為障礙的斑馬魚3只和野生型斑馬魚3只，冰板上快速將魚解剖取腦后，浸在體積分?jǐn)?shù)為4%的中性福爾馬林固定液中，送病理室切片，使用透射電鏡觀察腦超微結(jié)構(gòu)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用統(tǒng)計(jì)分析軟件 SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行數(shù)據(jù)描述;選用重復(fù)測量方差分析對(duì) 4 d內(nèi)各組潛伏期和累計(jì)停留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，組間兩兩對(duì)比選用 LSD 法。以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 T 型迷宮檢測斑馬魚到達(dá)、離開EC區(qū)潛伏時(shí)間

野生型斑馬魚在 T 型迷宮中尋找到 EC 區(qū)的潛伏時(shí)間以及遇到危險(xiǎn)逃離EC區(qū)潛伏時(shí)間明顯縮短，P＜0.001。見表2。

表2 T 型迷宮檢測斑馬魚到達(dá)和離開 EC 區(qū)潛伏時(shí)間(s)

2.2 T 型迷宮檢測不同月齡斑馬魚到達(dá)EC 區(qū)潛伏時(shí)間

1月齡及3月齡的APPswe細(xì)胞移植斑馬魚經(jīng)過訓(xùn)練后，與正常魚一樣，尋找到 EC 區(qū)的潛伏時(shí)間無明顯差別，P＞0.05。而 6月齡及12 月齡的APPswe細(xì)胞移植組斑馬魚經(jīng)過訓(xùn)練后，尋找到 EC 區(qū)的時(shí)間改變不明顯并隨月齡增加呈延長趨勢，與正常斑馬魚相比，具有顯著差異，P＜0.001。經(jīng)過T型迷宮行為學(xué)檢測，結(jié)果顯示，6月齡及12 月齡APPswe斑馬魚出現(xiàn)了游泳、覓食及躲避風(fēng)險(xiǎn)障礙。見表3。

2.3 斑馬魚腦超微結(jié)構(gòu)變化

有研究[5]顯示，斑馬魚的端腦區(qū)和皮質(zhì)區(qū)功能分別與靈長類動(dòng)物的海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)功能相似，都與學(xué)習(xí)記憶等行為有關(guān)。我們研究結(jié)果顯示，野生型斑馬魚神經(jīng)元細(xì)胞核呈圓形，核膜邊界清晰、光滑，胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器正常存在。行為障礙組6月齡斑馬魚細(xì)胞核腫脹，形態(tài)不規(guī)則，核膜厚薄不等并不規(guī)整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體腫脹;12月齡行為障礙斑馬魚的細(xì)胞器崩解破損，線粒體腫脹并出現(xiàn)空化，線粒體嵴間腔消失，細(xì)胞器減少或消失，細(xì)胞核塌陷皺縮。見圖4。

圖 4 透射電鏡下不同月齡斑馬魚的腦超微結(jié)構(gòu)

2.4 斑馬魚腦病理形態(tài)變化

挑選出現(xiàn)行為障礙的斑馬魚和野生型斑馬魚各3只，冰板上將魚解剖，取腦后浸在體積分?jǐn)?shù)為4%的中性福爾馬林固定液中，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋制作石蠟切片(8 μm)，放入60 ℃烤片機(jī)1 h后取片，Nissl染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀測，并利用 Image pro plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)尼氏染色神經(jīng)元數(shù)量。結(jié)果顯示，6 月齡APPswe斑馬魚腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量與正常野生型斑馬魚相比，神經(jīng)元減少;12月齡APPswe斑馬魚腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量與正常野生型斑馬魚相比，神經(jīng)元減少;12月齡APPswe斑馬魚腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量與6月齡APPswe斑馬魚相比，神經(jīng)元減少。見圖5。

圖 5 尼氏染色觀察不同月齡斑馬魚腦內(nèi)神經(jīng)元變化(Bar=50 μm)

表3 T 型迷宮檢測不同月齡斑馬魚到達(dá)EC 區(qū)潛伏時(shí)間(s)

3 討論

AD 的發(fā)病機(jī)制有很多假說，如膽堿能神經(jīng)元假說、Aβ 級(jí)聯(lián)學(xué)說、炎癥與免疫機(jī)制假說、氧化自由基假說、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)假說、胰島素相關(guān)糖代謝異常假說、鋁中毒假說和腦微血管病變假說等[6-8]。其中，Aβ級(jí)聯(lián)假說在AD 發(fā)病機(jī)制假說中理論依據(jù)較為充分而被廣泛接受，基于 Aβ 級(jí)聯(lián)假說我們建立了AD 細(xì)胞移植斑馬魚模型。

目前，隨著對(duì) AD 動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究，各種各樣的 AD 動(dòng)物模型被建立，但是完全模擬人類AD 病變特征的動(dòng)物模型仍然沒有被發(fā)現(xiàn)。AD 動(dòng)物模型的建立主要通過藥物誘導(dǎo) AD 動(dòng)物模型及轉(zhuǎn)基因 AD 動(dòng)物模型兩種方法來完成。本實(shí)驗(yàn)使用SH-SY5Y 細(xì)胞植入斑馬魚胚囊內(nèi)，是綜合藥物誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的。

斑馬魚作為新型模式生物，具有樣本量大，與哺乳動(dòng)物同源性高的特點(diǎn)，正好綜合了小鼠模型和無脊椎動(dòng)物模型兩者的優(yōu)勢。Lee[9]等利用斑馬魚appb基因啟動(dòng)子融合綠色熒光基因GFP，使得實(shí)驗(yàn)觀察更加精準(zhǔn)。APP 基因高表達(dá)產(chǎn)生的不斷增多的Aβ蛋白沉積在腦組織中，是導(dǎo)致大量AD 神經(jīng)元功能障礙的重要原因[10]。而APPswe突變體比野生型 APP能生產(chǎn)更多的mRNA 來編碼Aβ，大量Aβ集聚形成神經(jīng)元損傷，從而導(dǎo)致AD 的癥狀發(fā)生[11]。本研究通過構(gòu)建可調(diào)控β淀粉樣前體蛋白基因突變體 APPswe 表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體(pTetlIP-APPswe-EGFP)，繼 而 轉(zhuǎn) 染SHSY5Y 細(xì)胞中，最后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植到斑馬魚囊胚內(nèi)，在特定發(fā)育時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)過表達(dá) APPswe來模擬Aβ沉積的病理環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于斑馬魚行為學(xué)研究本實(shí)驗(yàn)除了選擇 T 迷宮試驗(yàn)考察斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力，還檢測斑馬魚自主活動(dòng)情況。利用Noldus-Vision系統(tǒng)進(jìn)行檢測斑馬魚在新環(huán)境中的自主活動(dòng)行為、探索行為、覓食行為等。正常情況下，斑馬魚具有趨底性，對(duì)于頂部的區(qū)域有畏懼感，在測試中主要表現(xiàn)為底部往返運(yùn)動(dòng)或者靜止在底部，上下探索較少。APPswe斑馬魚運(yùn)動(dòng)軌跡無規(guī)律性，在頂部出現(xiàn)次數(shù)明顯高于正常斑馬魚，說明APPswe斑馬魚出現(xiàn)對(duì)環(huán)境辨別能力下降改變。通過EC區(qū)覓食及面對(duì)危險(xiǎn)逃離實(shí)驗(yàn)顯示了APPswe斑馬魚存在記憶力減退、持續(xù)性認(rèn)知功能下降和運(yùn)動(dòng)障礙等AD 癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了本研究構(gòu)建的斑馬魚模型可以在不同的發(fā)育階段被誘導(dǎo)出現(xiàn)或加重AD 癥狀。

但是，不能培育APPswe 細(xì)胞移植斑馬魚后代，耗費(fèi)大量研究時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞移植，并且每條細(xì)胞移植斑馬魚在培育過程中可能過早死亡，限制了實(shí)驗(yàn)可持續(xù)研究。因此，構(gòu)建出可傳代的斑馬魚動(dòng)物模型，減低動(dòng)物模型的制作成本，并能為AD 發(fā)病機(jī)理與治療研究提供大量的動(dòng)物模型，是以后研究工作的重點(diǎn)。