張舒曼 董 爍 李淑蓮*

1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 外科，河南 開(kāi)封 475001; 2. 河南大學(xué) 細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004

熱休克轉(zhuǎn)錄因子1 (heat shock transcription factor1，Hsf1)是調(diào)節(jié)細(xì)胞保護(hù)性應(yīng)激蛋白-熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，能夠被熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激等多種理化因素激活[1-3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中伴有Hsf1表達(dá)變化，如心肌炎、肺部炎癥、關(guān)節(jié)炎等多種炎癥疾病過(guò)程中均有Hsf1的顯著改變。Hsf1能夠通過(guò)誘導(dǎo)Hsp表達(dá)，發(fā)揮間接抗炎反應(yīng)，也可通過(guò)多條途徑發(fā)揮直接抗炎效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用C57小鼠腹腔注射二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)24 h或48 h造成小鼠肝組織急性損傷，檢測(cè)小鼠肝組織Hsf1及其調(diào)控蛋白，分析Hsf1在急性肝損傷性炎癥中的表達(dá)及活性變化，豐富Hsf1與炎癥疾病相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

C57BL/6J小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司);二乙基亞硝胺(購(gòu)自Sigma公司);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海申能-德賽診斷技術(shù)有限 公司);Hsf1 抗體、Hsp25 抗體(購(gòu) 自Santa Cruz Biotechnology 公 司);Hsp70 抗 體、Hsp90 抗體(購(gòu)自中杉金橋公司);ECL 顯影試劑盒(購(gòu)自Amershem Pharmacia 公司);PVDF 膜(購(gòu)自Milipore 公司);垂直電泳儀及電轉(zhuǎn)裝置(Thermo EC公司產(chǎn)品);凝膠圖像分析儀Alphalmager2200(Alpha Inntech公司產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6J小鼠急性肝損傷模型的建立

選取8周齡C57BL/6J雄性小鼠30只，體質(zhì)量為(30±5)g。將30 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)、 DEN 損傷24 h組(n=10)及DEN 損傷48 h組(n=10)。DEN 損傷組C57BL/6J小鼠給予腹腔注射二乙基亞硝胺溶液，20 mg/kg;對(duì)照組腹腔注射同體積PBS溶液。三組小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，飲用商用純凈水。小鼠腹腔注射二乙基亞硝胺溶液24 h(DEN 損傷24 h組)或 48 h(DEN 損傷48 h組)，眼球取血后處死動(dòng)物。

1.2.2 肝組織病理檢查

C57BL/6J小鼠腹腔注射二乙基亞硝胺24 h或48 h后，迅速拉頸處死小鼠，并快速摘取小鼠肝臟，切取部分肝組織，置于體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中固定。常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.2.3 ALT、AST 及ALP的活性測(cè)定

C57BL/6J小鼠腹腔注射二乙基亞硝胺溶液24 h或48 h后，眼球取血，收集血清。按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清ALT、AST 和ALP活性。

1.2.4 提取小鼠肝組織蛋白

小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后脫頸處死，迅速摘取肝臟，切取適量肝臟組織，置于少量組織裂解液中，用無(wú)菌眼科剪剪碎肝組織，加組織裂解液(20 mM HEPES pH 7.5， 0.35 M NaCl， 20%甘油， 1% NP-40， 1mM MgCl2 86H2O， 0.5mM EDTA， 0.1 mMEGTA， PMSF)，冰上超聲裂解5 s×3次后冰上放置30 min，4 ℃， 12 000r/min，離心5min，收集上清，用BCA 法檢測(cè)上清液蛋白濃度。

1.2.5 小鼠肝組織Hsf1 及調(diào)控蛋白Hsp70、Hsp90、Hsp25蛋白檢測(cè)

常規(guī)提取小鼠肝組織蛋白60 μg，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉于TBST 室溫封閉PVDF膜1 h，洗滌4次，分別加入抗小鼠Hsf1、Hsp70、Hsp90、Hsp25 抗體，室溫孵育2 h，洗滌4次。將膜封閉于HRP 標(biāo)記的二抗稀釋液中，室溫孵育1 h， TBST 洗膜后，于ECL反應(yīng)液中再反應(yīng)1 min，暗室顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，單因素方差分析，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶活性變化

小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后，眼球取血，檢測(cè)血清ALT、AST、ALP的活性。與正常對(duì)照組小鼠比較顯示，DEN 24 h組小鼠血清ALT、AST 、ALP活性分別較對(duì)照組升高574.97%、86.67%、174.49%(P＜0.05)。DEN 48 h組小鼠血清ALT、AST 、ALP活性分別較對(duì)照組升高665.63%、95.33%、194.90%(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠血清ALT、AST、ALP活性比較

2.2 C57BL/6J小鼠肝組織病理變化

正常對(duì)照組小鼠肝臟組織內(nèi)肝索放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整， 細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均勻分布，肝組織中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)完整。與對(duì)照組小鼠比較， DEN 24 h組小鼠的肝臟體積明顯增大，并有充血現(xiàn)象;顯微鏡觀察可見(jiàn)肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞水腫，肝組織點(diǎn)狀及灶性壞死，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。DEN 48 h組小鼠肝臟組織及細(xì)胞損傷性變化更顯著。以上結(jié)果提示，小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h，導(dǎo)致肝組織急性嚴(yán)重?fù)p傷。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 DEN 損傷小鼠肝組織病理變化 (×200)

2.3 小鼠肝組織Hsf1蛋白表達(dá)

小鼠肝臟組織常規(guī)蛋白凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，免疫印跡檢測(cè)Hsf1蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后，肝組織Hsf1蛋白條帶較對(duì)照組明顯增粗。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 DEN 損傷小鼠肝組織Hsf1蛋白表達(dá)

2.4 小鼠肝組織Hsp70、Hsp90、Hsp25蛋白表達(dá)

取各組小鼠肝組織蛋白裂解液，常規(guī)SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)移PVDF膜，免疫印跡檢測(cè)Hsp70、Hsp90、Hsp25蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后，小鼠肝組織Hsp70、Hsp90及Hsp25蛋白條帶均較對(duì)照組明顯增粗。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 DEN 損傷小鼠肝組織Hsp70、Hsp90、Hsp25蛋白表達(dá)

3 討論

熱休克轉(zhuǎn)錄因子(Hsf)是一組在結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)化中比較保守的同源蛋白質(zhì)，普遍存在于生物細(xì)胞中。Hsf家族有Hsf1、Hsf2、Hsf3 和 Hsf4 四個(gè)成員，哺乳動(dòng)物基因有Hsf1、Hsf2 及 Hsf4，鳥(niǎo)類(lèi)基因中只含Hsf3。不同種屬的Hsf雖然結(jié)構(gòu)相似，但功能有著不同程度的差異，在Hsf家族中，Hsf1最具特征性，Hsf1在多個(gè)器官組織中均有表達(dá)，是調(diào)控細(xì)胞熱休克蛋白(Hsp)表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子[1-3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Hsf1不僅是調(diào)控 Hsp 表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，也與腫瘤、炎癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Hsf1不僅能夠通過(guò)誘導(dǎo)不同的Hsp表達(dá)而發(fā)揮間接的抗炎反應(yīng)[4-5]， 還具有重要的直接炎癥抑制作用。目前研究提示，Hsf1發(fā)揮直接抗炎效應(yīng)可能通過(guò)三個(gè)途徑:①Hsf1 能夠抑制炎癥因子轉(zhuǎn)錄。Hsf1 能夠與腫瘤壞死因子TNF-α基因上多個(gè)熱休克元件 (heat shock element， HSE) 結(jié)合，從而使TNF-α的轉(zhuǎn)錄受到抑制，進(jìn)而減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而Hsf1 基因缺失小鼠對(duì)脂多糖 (lipopolysaccharid， LPS) 所致全身炎癥反應(yīng)綜合征的敏感性增加，血漿TNF-α等炎癥介質(zhì)的水平增高，Hsf可保護(hù)小鼠免受脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[6-10];Hsf1也可抑制白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)、白 細(xì) 胞 介 素12(interleukin 12， IL-12)等炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄;Hsf1 還能對(duì)心肺炎癥、哮喘、關(guān)節(jié)炎、內(nèi)毒素血癥等炎性疾病的多種相關(guān)炎癥介質(zhì)進(jìn)行調(diào)控[11-13]。② Hsf1促進(jìn)抗炎因子生成。Hsf1能夠促進(jìn)白細(xì)胞介素4(interleukin 4， IL-4)、白細(xì)胞介素 10(interleukin 10， IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β， TGF-β) 等多種抗炎因子生成[14-15]。 ③Hsf1 調(diào)控炎癥信號(hào)通路中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。Hsf1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，抑制 NFκB的激活，阻止NF-κB 誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Hsf1也可直接抑制 AP-1的活化，減輕炎癥反應(yīng)程度[16-17]。

二乙基亞硝胺(DEN) 具有選擇性肝臟毒性，是常用的肝癌誘導(dǎo)劑。DEN 對(duì)肝臟的毒性作用歷經(jīng)一系列過(guò)程，DEN 首先使大鼠肝臟發(fā)生肝組織變性和壞死等中毒性改變，繼而出現(xiàn)肝硬化，最后形成彌漫性肝癌，即DEN 對(duì)肝臟的毒性作用，經(jīng)歷肝炎、肝硬化、進(jìn)而形成肝癌。課題組應(yīng)用間斷低劑量DEN 誘導(dǎo)小鼠肝癌模型[18]中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用DEN 是制作急性肝損傷模型較好的方法。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用C57BL/6J小鼠，腹腔注射DEN 24 h或48 h ，通過(guò)檢測(cè)小鼠血清酶活性及肝組織病理變化，確定小鼠急性中毒性肝損傷(炎癥)模型的建立。結(jié)果顯示，小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后，小鼠血清酶活性明顯增高，肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞，損傷性炎癥變化明顯。進(jìn)一步應(yīng)用免疫印跡方法檢測(cè)小鼠肝組織Hsf1及其調(diào)控蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔注射DEN 24 h后，肝組織Hsf1及其下游蛋白Hsp70、Hsp25較對(duì)照組肝組織明顯增多。腹腔注射DEN 48 h后，上述變化更顯著，提示DEN 誘導(dǎo)的急性肝組織損傷中，Hsf1 表達(dá)增多，轉(zhuǎn)錄活性增高。Hsp70、Hsp90、Hsp25均是Hsf1調(diào)控Hsp家族的重要成員，Hsp是機(jī)體重要的應(yīng)激保護(hù)蛋白，Hsp可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵信號(hào)通路，減少活性氧物質(zhì)(reactiveoxygen species，ROS) 形成等作用發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[19]。推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中Hsp70、Hsp90、Hsp25表達(dá)增多，可能通過(guò)其肝細(xì)胞保護(hù)作用，減輕DEN 造成的肝臟損傷，但DEN 誘導(dǎo)的急性肝損傷組織Hsp70、Hsp90及Hsp25表達(dá)增多的確切作用，以及Hsf1的表達(dá)增多是否具有直接抗炎作用尚需進(jìn)一步研究。